DE69933771T2 - Neurotrophischer wachstumsfaktor - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen neurotrophen Faktor sowie, insbesondere, das Klonieren und die Expression eines neuen Mitglieds der GDNF-Familie der neurotrophen Faktoren, welches im vorliegenden Schriftstück als "Enovin" (EVN) bezeichnet wird.
  • EINFÜHRUNG
  • Neurotrophe Faktoren spielen bei der Differenzierung, Entwicklung und Erhaltung von Nervenzellen eine Rolle. Diese Art von Proteinen kann der Entartung von verschiedenen Arten von Nervenzellen vorbeugen und deren Fortbestand fördern, weshalb diese Proteine ein potenzielles therapeutisches Mittel für neurodegenerative Krankheiten darstellen. Der neurotrophe Faktor, der sich aus Gliazell-Linien entwickelt (GDNF) war das erste Mitglied einer wachsenden Unterfamilie von neurotrophen Faktoren, die sich in ihrem Aufbau von Neurotrophinen unterscheiden. GDNF gehört zur Überfamilie der Wachstumsfaktoren, die als umwandelnde β-Wachstumsfaktoren (TGF-β) bezeichnet werden und innerhalb der Aminosäuresequenz durch ein bestimmtes Muster von sieben in hohem Maße erhaltenen Cysteinresten gekennzeichnet sind (Kingsley, 1994). Ursprünglich wurde GDNF unter Verwendung eines Assays aufgereinigt, welcher auf dessen Fähigkeit beruhte, in vitro das Überleben und die Funktion von ventralen embryonalen dopaminergen Mittelhirnnervenzellen zu gewährleisten (Lin et al., 1993). Andere Nervenzellarten im zentralen Nervensystem (CNS) oder im peripheren Nervensystem (PNS) reagieren ebenfalls die überlebensfördernde Wirkung von GDNF (Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al., 1995). GDNF wird von Zellen als inaktive Vorstufe produziert, welche an einer Erkennungsstelle für RXXR-Furin spezifisch gespalten wird, um die aktives (ausgereiftes) GDNF zu erhalten (Lin et al., 1993). In Tiermodellen der Parkinson'schen Krankheit, einer weit verbreiteten neurodegenerativen Störung, die durch den Verlust von bis zu 70 % der dopaminergen Zellen in der Substantia nigra des Gehirns gekennzeichnet ist, hat die exogene Verabreichung von GDNF starke neuroprotektive Wirkungen (Beck et al., 1995, Tomac et al.,1995, Cash et al., 1996, Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997).
  • In jüngerer Zeit wurden weitere neurotrophe Faktoren aus der GDNF-Familie entdeckt. Neurturin (NTN) wurde aus einem konditionierten Medium, das aus Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) gewonnen wurde, auf gereinigt, und zwar unter Verwendung eines Assays, der auf der Fähigkeit dieser Substanz beruht, das Überleben sympathischer Nervenzellen in Kultur zu fördern (Kotzbauer et al., 1996). Das ausgereifte NTN-Protein weist eine Ähnlichkeit von 57 mit dem ausgereiften GDNF auf. Persephin (PSP) wurde durch Klonieren entdeckt, und zwar mittels PCR mit degenerierten Primern, wobei genomische DNA als Template eingesetzt wurde. Wie das ausgereifte GDNF fördert das ausgereifte PSP das Überleben von ventralen dopaminergen Mittelhirnnervenzellen und von Motoneuronen in Kultur (Milbrandt et al., 1998). Die Ähnlichkeit des ausgereiften PSP-Proteins mit dem ausgereiften GDNF und NTN beträgt 50 %. Artemin (ARTN) wurde bei mittels DNA-Datenbanksuche entdeckt und stellt in Kultur einen Überlebensfaktor für Nervenzellen des Sympathikus und des Sinnesorgane dar (Baloh et al, 1988, Neuron (12),; 1291–1302). Ein weiterer neurotropher Faktor der GDNF-Familie wird in der PCT-Veröffentlichung WO00/01815 unter der Bezeichnung Neublastin offenbart.
  • Um die abwärts gerichtete intrazelluläre Signaltransduktion durchzuführen, benötigen GDNF, NTN, PSP und ARTN einen heterodimeren Rezeptorkomplex. GDNF bindet an die Alpha 1-Untereinheit des Rezeptors für die GDNF-Familie (GFRα-1, GFRα-Nomenklaturkomitee, 1997), wobei es sich um ein Membranprotein mit Glycosyl-Phosphatidyl-Inosit-Verankerung (glycosyl-PtdIns) handelt (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al., 1997). Der GDNF/GFRα-1-Komplex bindet anschließend an das cRET-Proto-Onkogen, eine membrangebundene Tyrosinkinase, und aktiviert diese (Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996), woraufhin es zu einer Phosphorylierung von Tyrosinresten im cRET und anschließend zu einer Aktivierung der abwärts gerichteten Signaltransduktionswege kommt (Worby et al., 1996). Mehrere andere Bauglieder der GFRα-Familie von ligandenbindenden Rezeptoren sind beschrieben worden (Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). GFRα-2 und GFRα-3 (Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Woby et al., 1998, Naveilham et al., 1998, Baloh et al., 1998a) sind von einer Reihe unterschiedlicher Arbeitsgruppen identifiziert worden. GFRα-1 und GFRα-2 werden weitverbreitet in fast allen Geweben exprimiert und die Expression kann entwicklungsseitig reguliert werden (Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).
  • GFRα-3 wird weder im sich entwickelnden zentralen Nervensystem noch im zentralen Nervensystem des Erwachsenen exprimiert, aber es wird in starkem Ausmaße in mehreren Ganglien der Sinnesorgane und des Sympathikus innerhalb des sich entwickelnden peripheren Nervensystems und des peripheren Nervensystems des Erwachsenen exprimiert (Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). Ein viertes Mitglied der Familie, GFRα-4, wurde aus Hühner-cDNA kloniert (Thompson et al., 1998). GFRα-1 ist der bevorzugte Rezeptor für GDNF, während GFRα-2 vorzugsweise an NTN bindet (Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). Hühner-GFRα-4 stellt einen funktionellen Rezeptorkomplex für PSP in Kombination mit cRET dar (Enokido et al., 1998). Zellen, die sowohl GFRα-3 als auch cRET exprimieren reagieren nachweislich weder auf GDNF noch auf NTN oder PSP (Worby et al., 1998, Baloh et al., 1998a). In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass ART Signale über cRET weiterleitet, wobei GFRα-3 als bevorzugter ligandenbindender Rezeptor verwendet wird (Baloh et al., 1998b). In vitro ist eine Wechselwirkung zwischen den neurotrophen Faktoren und GFRα-Rezeptoren möglich, da GDNF in Gegenwart von cRET an GFRα-2 oder GFRα-3 binden kann (Sanicola et al., 1997, Trupp et al., 1998) und NTN mit geringer Affinität an GFRα-1 binden kann (Klein et al., 1997). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass GDNF, NTN, PSP und ART einem neurotrophen Signalleitungssystem angehören, wobei verschiedene ligandenbindende Untereinheiten (GFRα-1 bis 4) mit derselben Tyrosinkinase-Untereinheit (cRET) in Wechselwirkung treten können. Die physiologische Bedeutung dieser in vitro-Entdeckungen wurde in jüngerer Zeit in Untersuchungen, bei denen Gene ausgeschaltet wurden, nachgewiesen (Übersichtsartikel von Rosenthal, 1999), wobei eindeutig gezeigt wurde, dass GDNF in vivo mit GFRα-1 in Wechselwirkung tritt, während NTN der bevorzugte Ligand für GFRα-2 ist.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Enovin (EVN), das vierte Mitglied der GDNF-Familie, identifiziert, kloniert, exprimiert, auf dem Chromosom lokalisiert und charakterisiert. Die Kenntnis des ausgereiften EVN-Proteins wurde durch die Entdeckung verschiedener funktioneller und nicht funktioneller mRNA-Spleißvarianten erweitert. Darüber hinaus machen wir Angaben zur Expression und zum Bindungsverhalten von EVN gegenüber GFRα-3 sowie zu den in vitro-Wirkungen von EVN auf das Ausreifen von Neuriten und auf den Schutz gegen taxolinduzierte Neurotoxizität in Kulturen von menschlichen Staurosporin-differenzierten SH-SY5Y Neuroblastomzellen.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • In der vorliegenden Anmeldung werden ein Nukleinsäuremolekül, welches für einen neuartigen menschlichen neurotrophen Wachstumsfaktor namens "Enovin" codiert, ein Expressionsvektor, welcher das Nukleinsäuremolekül umfasst, eine Wirtszelle, welche mit dem Vektor transformiert wurde, ein neurotropher Wachstumsfaktor, für welchen das Nukleinsäuremolekül codiert, isoliertes Enovin sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Nukleinsäure oder das Enovinprotein enthalten, bereitgestellt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, welches für einen menschlichen neurotrophen Wachstumsfaktor, der im vorliegenden Schriftstück als Enovin bezeichnet wird, codiert und die Aminosäuresequenz, die in 21 dargestellt ist (SEQ ID Nr.4), aufweist oder welches für ein funktionelles Äquivalent, ein Derivat oder eine biologische Vorläufersubstanz des Wachstumsfaktors codiert, insbesondere für das lange (23 – SEQ ID Nr. 9), das kurze (24 – SEQ ID Nr.10) und weitere Spleißvarianten, die in 21 (SEQ ID Nr. 11, 12, 13, 14 oder 15) dargestellt sind. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um DNA und insbesondere um ein cDNA-Molekül.
  • Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure gemäß der Erfindung die Sequenz aus den Positionen 81 bis 419 der Sequenz, die in 1 (SEQ ID Nr. 2) dargestellt ist, insbesondere jedoch aus deren Positionen 81 bis 422 sowie mit besonderem Vorzug die gesamte Sequenz, die in 1 dargestellt ist.
  • Von dem Nukleinsäuremolekül aus den Positionen 81 bis 419 wird angenommen, dass es für die Sequenz des ausgereiften Enovinproteins codiert, welches durch Bearbeitung der Vorstufe des Proteins an der RXXR-Bearbeitungsstelle, über welche die stabile Vorstufe des Enovinproteins verfügt, entsteht.
  • Im vorliegenden Schriftstück beziehen sich Angaben zur Stringenz der Hybridisierung auf Bedingungen, unter denen Polynukleinsäuren stabil sind. Die Stabilität von Hybriden entspricht der Schmelztemperatur (Tm) dieser Hydride. Tm kann näherungsweise nach folgender Formel berechnet werden: 81,5 °C-16,6 (log10[Na+] + 0,41 (%G&C) – 600/lwobei 1 für die Länge der Hybride in Nukleotiden steht. Bei einer Abnahme der Sequenzhomologie um 1% sinkt Tm näherungsweise um 1 bis 1,5 °C.
  • Das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann vorteilhafterweise dazu verwendet werden, den menschlichen neurotrophen Wachstumsfaktor gemäß der Erfindung zu exprimieren, und zwar unter Verwendung eines geeigneten Expressionsvektors in einer Wirtszelle oder Ähnlichem.
  • Zu den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren gehören Vektoren, die dazu befähigt sind, DNA, welche operativ mit Regulationssequenzen verbunden ist, zu exprimieren, wie dies etwa bei Promotorbereichen, welche dazu befähigt sind, die Expression solcher DNA-Fragmente zu bewirken, der Fall ist.
  • Zu den Regulationselementen, die für die Expression erforderlich sind, gehören Promotorsequenzen als Bindestellen für die RNA-Polymerase sowie Transkriptionsinitiationssequenzen als Bindestellen für Ribosomen. Ein bakterieller Expressionsvektor kann zum Beispiel einen Promotor wie etwa den lac-Promotor, die Shine-Dalgarno-Sequenz zur Transkriptionsinitiation sowie das Startcodon AUG umfassen. In ähnlicher Weise kann ein eukaryotischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promotor für die RNA-Polymerase II, ein abwärts gerichtetes Polyadenylierungssignal, das Startcodon AUG sowie ein Endcodon zum Loslösen des Ribosoms umfassen. Solche Vektoren können im Handel erworben werden oder mit Hilfe von Verfahren, die innerhalb des Fachgebietes wohlbekannt sind, aus den beschriebenen Sequenzen zusammengesetzt werden.
  • Somit bezeichnet der Begriff Expressionsvektor ein Konstrukt aus rekombinanter DNA oder RNA wie etwa ein Plasmid, einen Phagen, ein rekombinantes Virus oder einen anderen Vektor, dessen Einschleusung in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der DNA- oder RNA-Fragmente führt. Zu den geeigneten Expressionsvektoren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, gehören solche, die in eukaryotischen Zellen und/oder prokaryotischen Zellen replizierbar sind, und solche, die episomal bleiben, sowie solche, die sich in das Genom der Wirtszelle integrieren.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in die beschriebenen Vektoren in antisense-Richtung eingefügt werden, um für die Produktion von antisense-RNA zu sorgen. Die antisense-RNA oder andere antisense-Nukleinsäuren können auf synthetische Weise hergestellt werden.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst das Transformieren, Transfizieren oder Infizieren der Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wobei die Zelle vorzugsweise eine eukaryotische Zelle und insbesondere eine Säugetierzelle umfasst.
  • Das Einfügen von klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor zur anschließenden Transformation der Zelle mit darauf folgender Selektion der transformierten Zellen ist dem Fachmann wohlbekannt, wobei auf Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, verwiesen sei.
  • Ferner wird ein Nukleinsäuremolekül mit wenigstens 15 Nukleotiden des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls und vorzugsweise 15 bis 50 Nukleotiden beschrieben.
  • Diese Sequenzen können vorteilhafterweise als Sonden oder Primer eingesetzt werden, um die Replikation oder Ähnliches einzuleiten. Solche Nukleinsäuremoleküle können mit Hilfe von Techniken hergestellt werden, die innerhalb des Fachgebietes wohlbekannt sind, wie etwa mittels Rekombination oder Synthese. Sie können weiterhin in diagnostischen Kits oder Vorrichtungen oder Ähnlichem verwendet werden, um das Vorhandensein einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung nachzuweisen. Diese Tests umfassen im Allgemeinen das Inkontaktbringen der Sonde mit einer Probe unter hybridisierenden Bedingungen und den Nachweis des Vorhandenseins beliebiger gebildeter Duplexe aus der Sonde und einer beliebigen Nukleinsäure in der Probe.
  • Diese Sonden können auf einem feststofflichen Trägermaterial verankert sein. Vorzugsweise befinden sie sich auf einem Array, sodass mehrere Sonden gleichzeitig mit einer einzigen biologischen Probe hybridisieren können. Die Sonden können punktförmig auf das Array aufgebracht werden oder in situ auf dem Array synthetisiert werden. (Siehe Lockhart et al., Nature Biotechnology, vol. 14, December 1996 "Expression monitoring by hybridisation into high density oligonucleotide arrays". Ein einziges Array kann mehr als 100, 500 oder sogar 1.000 verschiedene Sonden an getrennten Stellen enthalten.
  • Die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung können ebenfalls hergestellt werden, indem Mittel der Rekombination oder der Synthese eingesetzt werden, wie beispielsweise die Mechanismen des PCR-Klonierens, im Rahmen derer im Allgemeinen ein Primerpaar hergestellt wird, welches sich größenmäßig zwischen näherungsweise 10 bis 50 Nukleotiden und einem Bereich des zu klonierenden Gens bewegt, woraufhin die Primer mit mRNA, cDNA oder genomischer DNA aus einer menschlichen Zelle in Kontakt gebracht werden, um eine Polymerase-Kettenreaktion unter Bedingungen, die zur Vervielfältigung des gewünschten Bereiches führen, durchzuführen, woraufhin der vervielfältigte Bereich oder das vervielfältigte Fragment isoliert und die vervielfältigte DNA wiedergewonnen wird. Im Allgemeinen sind die Techniken, die den Begriffsbestimmungen im vorliegenden Schriftstück entsprechen, innerhalb des Fachgebietes wohlbekannt, wobei für eine Beschreibung etwa auf Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989) verwiesen sei.
  • Die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung oder die beschriebenen Oligonukleotide können mit einem Erkennungsmarker versehen sein.
  • Zu den geeigneten Markern gehören Radioisotope wie etwa 32P oder 35S, Enzymmarker oder andere Proteinmarker wie etwa Biotin oder fluoreszierende Marker. Die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide können mit solchen Markern versehen und mittels an sich bekannter Techniken detektiert werden.
  • Menschliche allelische Varianten oder Polymorphismen der DNA-Moleküle gemäß der Erfindung können vorteilhafterweise zum Beispiel identifiziert werden, indem cDNA oder Genomdatenbanksätze aus einer Spannbreite von Individuen, die zum Beispiel aus verschienen Bevölkerungsgruppen stammen, sondiert werden. Darüber hinaus können die im vorliegenden Schriftstück beschriebenen Nukleinsäuren und Sonden verwendet werden, um genomische DNA von Patienten zu sequenzieren, und zwar unter Verwendung von Techniken, die innerhalb des Fachgebietes wohlbekannt sind, wie etwa dem Sanger-Dideoxy-Kettenabbruchverfahren, wodurch vorteilhafterweise jedwede Prädisposition eines Patient für bestimmte Störungen, die mit einem Wachstumsfaktor gemäß der Erfindung in Zusammenhang stehen, festgestellt werden kann.
  • Weiterhin wird eine transgene Zelle, ein transgenes Gewebe oder ein transgener nichtmenschlicher Organismus beschrieben, welche/welches/welcher ein Transgen umfasst, das befähigt ist, den erfindungsgemäßen menschlichen neurotrophen Faktor Enovin zu exprimieren.
  • Der Begriff "Transgen, das befähigt ist zu exprimieren" bezeichnet im vorliegenden Schriftstück eine beliebige geeignete Nukleinsäuresequenz, die zur Expression eines neurotrophen Faktors mit der gleichen Funktion und/oder Aktivität wie ein neurotropher Faktor gemäß der Erfindung aufweist. Das Transgen kann beispielsweise genomische Nukleinsäure, die aus menschlichen Zellen isoliert wurde, oder synthetische Nukleinsäure einschließlich cDNA umfassen, wobei diese in das Chromosom integriert ist oder sich in extrachromosomalem Zustand befindet.
  • Vorzugsweise umfasst das Transgen einen Vektor gemäß der Erfindung, wobei der Vektor ein Nukleinsäuremolekül, das für den neurotrophen Faktor codiert, oder ein funktionelles Fragment des Nukleinsäuremoleküls umfasst. Unter einem "funktionellen Fragment" der Nukleinsäure ist ein Fragment des Gens oder der cDNA zu verstehen, das für den neurotrophen Faktor codiert, oder ein funktionelles Äquivalent davon, wobei das Fragment befähigt ist, exprimiert zu werden, um einen funktionellen neurotrophen Wachstumsfaktor gemäß der Erfindung zu produzieren. Somit sind zum Beispiel Fragmente des neurotrophen Wachstumsfaktors gemäß der Erfindung, welche die spezifischen Aminosäurereste, die mit dem entsprechenden Rezeptor in Wechselwirkung treten, aufweisen, ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung, wobei die Fragmente als Agonisten dienen können, die den entsprechenden Rezeptor des Wachstumsfaktors gemäß der Erfindung aktivieren, um dessen wachstumsfördernde und lebenserhaltende Wirkung auf Zellen auszulösen. Dieser Aspekt der Erfindung umfasst ebenfalls verschiedene differenziell gespleißte Isoformen und Transkriptionsstarts der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Begriffsbestimmung einer Nukleinsäure nicht nur die Nukleinsäure selbst, sondern auch beliebige kleinere Abweichungen bei den Basen einschließlich insbesondere des Ersetzens von Basen, wobei aufgrund des degenerierten Codes bei konservativer Aminosäuresubstitution ein synonymes Codon entsteht (ein anderes Codon, das denselben Aminosäurerest festlegt). Der Begriff "Nukleinsäuremolekül" umfasst weiterhin die komplementäre Sequenz zu einer beliebigen gegebenen Einzelstrangsequenz unter Berücksichtigung von Abweichungen bei den Basen.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen isolierten menschlichen neurotrophen Wachstumsfaktor bereit, für welchen ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück codiert. Vorzugsweise umfasst der Wachstumsfaktor eine Aminosäuresequenz, die von Position 27 bis 139 der Aminosäuresequenz in 1 reicht.
  • Unter einem "funktionellen Äquivalent" gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück ist ein Wachstumsfaktor zu verstehen, der sämtliche Wachstumseigenschaften und Funktionen, die mit dem Wachstumsfaktor Enovin in Verbindung zu bringen sind, zeigt. Der Begriff Enovin-"derivat" ist gemäß der Begriffsbestimmung im vorliegenden Schriftstück derart aufzufassen, dass er ein Polypeptid umfasst, in welchem bestimmte Aminosäuren beschädigt, entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität des Enovins beibehält und/oder wobei das Polypeptid mit Antikörpern, die sich unter Einsatz von Enovin gemäß der Erfindung entwickelt haben, als entsprechendes Antigen reagiert.
  • In den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung fallen auch Hybridformen und modifizierte Formen des Enovins einschließlich der Fusionsproteine und Fragmente. Zu den Hybridformen und modifizierten Formen gehören zum Beispiel solche, bei denen bestimmte Aminosäuren einer gewissen Abänderung unterzogen wurden oder ersetzt wurden, beispielsweise durch Punktmutation, wobei jedoch trotz der Modifizierungen noch ein Protein entsteht, welches die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Enovins beibehält. Bestimmte Nukleinsäuresequenzen können vom Fachmann dahingehend abgeändert werden, dass die einen Wachstumsfaktor produzieren, der dieselben oder im Wesentlichen gleiche Eigenschaften wie Enovin zeigt.
  • Wie innerhalb des Fachgebietes wohlbekannt ist, werden viele Protein in vivo mit einer (Prä)Signalsequenz am N-Ende des Proteins produziert. Darüber hinaus können solche Proteine eine weitere Prosequenz umfassen, die eine stabile Vorstufe zum ausgereiften Protein darstellt. Solche Prä- und Prosequenzen sind im Allgemeinen für die biologische Aktivität nicht erforderlich. Das Enovinmolekül gemäß der Erfindung umfasst nicht nur die gesamte Länge der Sequenz, die in 21 dargestellt ist, sondern auch den Bereich von Position 27 bis 139, der auf die proteolytische RXXR-Bearbeitungsstelle, die in Wachstumsfaktoren dieser Art vorhanden ist, folgt und von der angenommen wird, dass sie für die ausgereifte Enovinsequenz steht.
  • Ein bestimmtes Protein, Polypeptid oder eine bestimmte Aminosäuresequenz gemäß der Erfindung umfasst nicht nur die entsprechende Aminosäuresequenz selbst, sondern auch deren Isomere sowie Abweichungen in den Aminosäuren mit Bezug auf die natürliche Aminosäuresequenz einschließlich konservativer Aminosäuresubstitutionen (Ersatz durch eine Aminosäure, die hinsichtlich ihrer Seitenkette verwandt ist). Eingeschlossen sind weiterhin Aminosäuresequenzen, die von der natürlichen Aminosäure abweichen, aber zu einem Polypeptid führen, das verglichen mit dem Polypeptid, für welches die natürlich vorkommende Sequenz codiert, immunologisch identisch oder ähnlich ist.
  • Zu den erfindungsgemäßen Proteinen oder Polypeptiden gehören weiterhin Varianten solcher Sequenzen, einschließlich natürlich vorkommender allelischer Varianten, die im Wesentlichen Homologa dieser Proteine oder Polypeptid sind. In diesem Zusammenhang wird als eine Sequenz als im Wesentlichen homolog angesehen, wenn sie eine mindestens 70 %ige und vorzugsweise 80 %ige, 90 %ige oder 95 %ige Aminosäurehomologie mit den Proteinen oder Polypeptiden, für welche die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung codieren, aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin neurotrophe Wachstumsfaktoren, die von den erfindungsgemäßen Wirtszellen exprimiert werden.
  • Aufgrund der Ähnlichkeit der Sequenzen zwischen dem Wachstumsfaktor, der im vorliegenden Schriftstück beschrieben ist, und bereits identifizierten Wachstumsfaktoren aus der GDNF-Familie wird angenommen, dass Enovin dazu befähigt ist, das Überleben und das Wachstum von Zellen zu fördern, und Störungen zu behandeln vermag, die sich aus Fehlfunktionen oder Fehlexpressionen des neurotrophen Faktors ergeben.
  • Es wurde beobachtet, dass der neurotrophe Wachstumsfaktor gemäß der Erfindung vorteilhafterweise auf Nervenzellen oder -zellbestände eine neurotrophe oder neuroprotektive Wirkung ausübt, insbesondere auf solche Nervenzellen oder -zellbestände, bei deren eine Apoptose induziert wurde. Dementsprechend können die Nukleinsäure oder der Enovin-Wachstumsfaktor selbst gemäß der Erfindung darüber hinaus als Medikament eingesetzt werden.
  • Weiterhin, wie ausführlicher im untenstehenden Beispiel beschrieben ist, wurde gezeigt, dass Enovin die Genesung induzierter Mängel in der Sinneswahrnehmung beschleunigt, was Enovin zu einem Kandidaten für die Behandlung oder Linderung von Schmerzsyndromen mit einer peripheren oder zentralen neurogenen Komponente, rheumatischen/entzündlichen Erkrankungen sowie Leitwertstörungen macht, wobei es einem bedürftigen Patienten in einer Konzentration verabreicht wird, die ausreicht, um die Symptome dieser Störungen zu vermindern oder ihnen vorzubeugen.
  • Eine alternatives Verfahren zur Behandlung der oben beschriebenen Nervenstörungen umfasst das Implantieren von Zellen, die einen menschlichen neurotrophen Wachstumsfaktor gemäß der Erfindung exprimieren, wie dies etwa bei den transgenen Zellen, die im vorliegenden Schriftstück beschrieben sind, der Fall ist, in einen Patienten.
  • Die Nukleinsäuremoleküle und der neurotrophe Wachstumsfaktor gemäß der Erfindung können weiterhin Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung sein, und zwar gemeinsam mit einem geeigneten pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Bindemittel.
  • Antikörper für den neurotrophen Faktor der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise mit Hilfe von Techniken hergestellt werden, die innerhalb des Fachgebietes bekannt sind. Polyklonale Antikörper zum Beispiel können hergestellt werden, indem ein Wirtstier wie etwa eine Maus mit dem Wachstumsfaktor oder einem Epitop davon inokuliert wird, woraufhin das Immunserum gewonnen wird. Monoklonale Antikörper können gemäß bekannten Techniken wie etwa denen, die von Kohler R. and Milstein C. (Nature (1975) 256, 495–497) beschrieben wurden, hergestellt werden.
  • Erfindungsgemäße Antikörper können vorteilhafterweise in einem Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Wachstumsfaktors gemäß der Erfindung verwendet werden, wobei dieses Verfahren das Umsetzen des Antikörpers mit einer Probe und das Identifizieren eines beliebigen Proteins, das an diesen Antikörper gebunden ist, umfasst. Weiterhin wird ein Kit zur Durchführung des Verfahrens bereitgestellt, wobei das Kit einen Antikörper gemäß der Erfindung sowie Mittel für das Umsetzen des Antikörpers mit der Probe umfasst.
  • Darüber hinaus wird durch die vorliegende Erfindung ein Kit oder eine Vorrichtung zum Nachweis des Vorhandenseins eines erfindungsgemäßen neurotrophen Wachstumsfaktor in einer Probe bereitgestellt, wobei das Kit einen Antikörper gemäß der obigen Beschreibung sowie Mittel für das Umsetzen des Antikörpers mit der Probe umfasst.
  • Proteine, die mit dem neurotrophen Faktor der Erfindung in Wechselwirkung treten, wie beispielsweise der dementsprechende zelluläre Rezeptor können identifiziert werden, indem die Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Zweihybrid-Vektorsystems, das Molekularbiologen wohlbekannt ist (Fields & Song, Nature 340:245 1989) untersucht werden. Diese Technik beruht auf der funktionellen Rekonstitution in vivo eines Transkriptionsfaktors, der das Reportergen aktiviert. Insbesondere umfasst die Technik das Bereitstellen einer geeigneten Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt, welches ein Reportergen umfasst, das von einem Promotor gesteuert wird, welcher mittels eines Transkriptionsfaktors mit einem DNA-bindenden Bereich und einem aktivierenden Bereich reguliert wird, wobei in der Wirtszelle eine erste Hybrid-DNA-Sequenz exprimiert wird, die für eine erste Fusion eines Fragments oder der Gesamtheit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit entweder dem DNA-bindenden Bereich oder dem aktivierende Bereich des Transkriptionsfaktors codiert, wobei in dem Wirt mindestens eine zweite Hybrid-DNA-Sequenz, wie etwa eine Datenbank oder Ähnliches exprimiert wird, welche für putative Bindungsproteine codiert, die gemeinsam mit dem DNA-bindenden Bereich oder dem aktivierenden Bereich des Transkriptionsfaktors, welcher nicht in die erste Fusion mit eingeht, untersucht werden sollen; den Nachweis jedweder Bindung, welche die zu untersuchenden Proteine mit einem Protein gemäß der Erfindung eingehen, und zwar durch Nachweis des Vorhandenseins eines beliebigen Produktes des Reportergens in der Wirtszelle; wahlweise das Isolieren der zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen, die für das Bindungsprotein codieren.
  • In einem Beispiel für eine derartige Technik wird das GAL4-Protein in Hefe verwendet. Bei GAL4 handelt es sich um einen transkriptionellen Aktivator des Galactosestoffwechsels in Hefe, welcher einen separaten Bereich zum Binden an Aktivatoren strangaufwärts der Galactosestoffwechselgene sowie einen proteinbindenden Bereich aufweist. Es können Nukleotidvektoren konstruiert werden, von denen einer die Nukleotidreste, welche für den DNA-bindenden Bereich von GAL4 codieren, umfasst. Diese Bindungsbereichreste können zu einer bekannten proteincodierenden Sequenz wie beispielsweise zu Nukleinsäuren gemäß der Erfindung verschmolzen werden. Der andere Vektor umfasst die Reste, die für den proteinbindenden Bereich von GAL4 codieren. Diese Reste werden mit Resten verschmolzen, die für ein Testprotein, vorzugsweise aus dem Signaltransduktionsweg des betreffenden Wirbeltiers, codieren. Jedwede Wechselwirkung zwischen dem neurotrophen Faktor, für welchen die Nukleinsäure gemäß der Erfindung codiert und dem zu untersuchenden Protein führt zur transkriptionellen Aktivierung eines Reportermoleküls in einer Hefezelle mit GAL4-Transkriptionsmangel, in welcher die Vektoren transformiert wurden. Vorzugsweise wird ein Reportermolekül wie etwa β-Galactosidase bei der Wiederaufnahme der Transkription der Gene der Galactosestoffwechsels der Hefe aktiviert.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben GFRα3 als Rezeptor für Enovin identifiziert. Es können daher Assays zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten von Enovin hergestellt werden. Ein solcher Assay kann auch in Verbindung mit weiteren neurotrophen Wachstumsfaktoren und ihren entsprechenden Rezeptoren zum Einsatz kommen. Die identifizierten Verbindungen können eingesetzt werden, um Störungen wie etwa die Parkinson'sche Krankheit, Alzheimer, Neuronale Störungen, die mit verlängerten Polyglutaminsequenzen in Verbindung stehen, die Huntingdon-Krankheit, periphere Neuropathie, akute Gehirnverletzungen, Tumoren des Nervensystems, multiple Sklerose; amyotrophe Lateralsklerose, peripheres Nerventrauma oder Einwirkung von Neurotoxinen, multiple endokrine Neoplasie und familiäre Hirschsprung-Krankheit, Erkrankungen, die mit Prionen in Verbindung stehen, die Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Schlaganfall, Schmerzsyndrome mit einer im Wesentlichen peripheren oder zentralen Komponente, rheumatische/entzündliche Erkrankungen sowie Leitwertstörungen zu behandelt oder ihnen vorzubeugen, indem einem Individuum der Agonist oder Antagonist in ausreichender Konzentration verabreicht wird, um diesen nervlichen Störungen vorzubeugen oder sie zu behandeln. Derartige Verbindungen können auch Bestandteil von pharmazeutischen Zusammensetzungen sein, und zwar gemeinsam mit einem geeigneten pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Bindemittel.
  • Gemäß einer Ausführungsform können Agonisten oder Antagonisten eines Wachstumsfaktors (wie beispielsweise Enovin) identifiziert werden, indem ein Zellgewebe oder nichtmenschlicher Organismus, welches/welcher einen geeigneten Rezeptor sowie cRET exprimiert, mit einer Kandidatenverbindung in Gegenwart des Wachstumsfaktors umgesetzt wird, wobei das Niveau der RET-Aktivierung in der Zelle, dem Gewebe oder dem nichtmenschlichen Organismus mit einem Kontrollansatz, der nicht mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wurde, verglichen wird.
  • Eine alternative Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten eines neurotrophen Wachstumsfaktors, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines Zellgewebes oder eines nichtmenschlichen Organismus, welches/welcher einen geeigneten Rezeptor sowie cRET exprimiert, mit einer Kandidatenverbindung in Gegenwart des Wachstumsfaktors umfasst, wobei das Niveau der Aktivierung der Signalleitungskinase im Signaltransduktionsweg, dem der geeignete Rezeptor angehört, gemessen wird, woraufhin ein Antikörper, der für die Signalkinase, die an ein Reportermolekül gebunden ist, spezifisch ist, hinzugefügt wird, wobei die Messung im Vergleich mit einem Zellgewebe oder einem nichtmenschlichen Organismus, der nicht mit der Verbindung in Kontakt gebracht wurde, durchgeführt wird.
  • Wie ausführlicher in den untenstehenden Beispielen ausgeführt ist, konnte Enovin taxolinduzierte Mängel in der Sinneswahrnehmung erfolgreich vermindern. Daher könnte Enovin bei Schmerzsyndromen mit einer im wesentlichen peripheren und zentralen neurogenen Komponente, bei rheumatischen Erkrankungen sowie bei Leitwertstörungen möglicherweise eine Rolle spielen, und es kann nach transdermaler, topischer, lokalzentraler (wie etwa epidural, intrathekal, ICV, intraplexus, intraneuronal), peroraler, rektaler und systemischer Anwendung bei Vorgängen der Sinneswahrnehmung die Rolle eines Moderators spielen. Daher können diese Zustände auf dieselbe Weise, die im vorliegenden Schriftstück für andere Zustände, bei denen Enovin eine vermittelnde Rolle spielt, beschrieben ist, gelindert oder sogar verhindert werden, indem entweder ein antisense-Molekül, eine Nukleinsäure, das Enovinprotein, eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine Verbindung, die als Agonist oder Antagonist identifiziert wurde, in geeigneter Weise und gemäß der Erfindung in Konzentrationen verabreicht wird, die ausreichen, um die Symptome der Störung(en) zu lindern oder ihnen vorzubeugen.
  • Die therapeutischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können über einen beliebigen geeigneten Weg, der innerhalb des Fachgebietes bekannt ist, verabreicht werden, einschließlich beispielsweise der intravenösen, subkutanen, intramuskulären, transdermalen, intrathekalen oder intrazerebralen Verabreichung an Zellen im Rahmen von ex vivo Behandlungsprotokollen. Die Verabreichung kann entweder schnell mittels Injektion erfolgen, oder aber über einen gewissen Zeitraum hinweg mittels langsamer Infusion oder mittels Verabreichung einer Formulierung zur verzögerten Freisetzung. Zur Behandlung von Geweben innerhalb des zentralen Nervensystems kann die Verabreichung durch Injektion oder Infusion in die zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) erfolgen.
  • Enovin kann darüber hinaus mit Mitteln in Verbindung gebracht oder konjugiert werden, die erstrebenswerte pharmazeutische oder pharmakodynamische Eigenschaften aufweisen. Es kann zum Beispiel an eine beliebige Substanz, die innerhalb des Fachgebietes bekannt, ist gekuppelt werden, um das Eindringen oder den Transport über die Blut-Hirn-Schranke zu fördern, wobei es sich etwa um einen Antikörper zum Transferrinrezeptor handeln kann und wobei die Verabreichung mittels intravenöser Injektion erfolgt.
  • Enovin, die antisense-Molekül oder auch die Verbindungen, die als Agonisten oder Antagonisten von Enovin identifiziert wurden (wobei letztere nicht Teil der Erfindung sind) können in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, die gemäß den Verfahren, die innerhalb des Fachgebietes wohlbekannt sind, zubereitet werden kann. Zu den bevorzugten Zusammensetzungen gehören pharmazeutisch unbedenkliche Vehikel oder Verdünnungsmittel oder Trägerstoffe wie beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung. Weitere pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffe einschließlich ungiftiger Salze, sterilen Wassers oder ähnlicher Stoffe können ebenfalls verwendet werden. Weiterhin kann ein geeigneter Puffer vorhanden sein, der es ermöglicht, die Zusammensetzungen zu lyophilisieren und unter sterilen Bedingungen zu lagern, und zwar bis zur Rekonstitution mittels Zugabe von sterilem Wasser für die anschließende Verabreichung. Das Enovin kann in eine feststoffliche oder halbfeste biologisch verträgliche Matrix eingearbeitet werden, welche in die zu behandelnden Gewebe implantiert werden kann.
  • Der Trägerstoff kann darüber hinaus andere pharmazeutisch unbedenkliche, medizinisch unwirksame Bestandteile zur Beeinflussung anderer Bedingungen wie etwa des pH-Wertes, der Osmolarität, der Viskosität, der Sterilität, der lipophilen Eigenschaften, der Löslichkeit oder ähnlicher Bedingungen enthalten. Es können pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffe enthalten sein, die eine fortwährende oder verzögerte Freisetzung nach der Verabreichung ermöglichen.
  • Das Enovinprotein oder die Nukleinsäuremoleküle oder – verbindungen gemäß der Erfindung können oral verabreicht werden. In dieser Ausführungsform können sie verkapselt und mit geeigneten Trägerstoffen in Form von festen Dosiereinheiten kombiniert werden, welche dem Fachmann wohlbekannt wären.
  • Wie dem Fachmann wohlbekannt wäre, kann die spezifische Dosierungsvorschrift in Abhängigkeit vom jeweils zur Anwendung kommenden Verabreichungsweg gemäß der Körperoberfläche des Patienten oder gemäß dem Volumen des Körperbereiches, innerhalb dessen der Wirkstoff sich ausbreiten soll, berechnet werden. Die Menge der Zusammensetzung, die tatsächlich verabreicht wird, wird indes von einem praktischen Arzt festgelegt, und zwar auf Grundlage der Begleitumstände der zu behandelnden Störung wie etwa der Schwere der Symptome, der zu verabreichenden Zusammensetzung, des Alters, des Gewichts und der Reaktion des jeweiligen Patienten sowie des gewählten Verabreichungsweges.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele eindeutiger zu verstehen sein, welche rein exemplarisch sind und sich auf die beigefügten Zeichnungen beziehen, wobei:
  • 1 eine partielle cDNA-Sequenz eines neurotrophen Faktors gemäß der Erfindung zeigt, welcher als Enovin bezeichnet wird. Die Konsenssequenz wurde durch PCR-Vervielfältigung mit den Primern PNHsp3 und PNHap1 erhalten, wobei dieses Verfahren auf verschiedene cDNAs sowie auf genomische DNA angewendet und wobei anschließend kloniert und eine Sequenzanalyse durchgeführt wurde, um die erhaltenen Sequenzen zu vergleichen. Der vorhergesagte Ein-Buchstaben-Code der Aminosäuresequenz ist oberhalb der DNA-Sequenz dargestellt. Die Anzahl der Nukleotidreste ist rechts von der DNA-Sequenz angegeben, während die Anzahl der Aminosäurereste rechts von der translatierten Proteinsequenz angegeben ist. Die putative RXXR-Spaltungsstelle für die Prodomäne ist unterstrichen und fett gedruckt. Der putative Start des ausgereiften Proteins wird durch einen Pfeil angezeigt. Die sieben erhaltenen Cysteinreste, die für sämtliche Mitglieder der TGF-β-Familie kennzeichnend sind, werden durch Fettdruck angezeigt. Eine potenzielle N-Glycosylierungsstelle ist doppelt unterstrichen,
  • 2 eine Alinierung der vorhergesagten ausgereiften Proteinsequenzen von menschlichem GDNF, NTN, PSP und EVN zeigt. Die Sequenzen sind unter Verwendung des Alinierungsprogramms ClustalW aliniert worden. Diejenigen Aminosäurereste, die zwischen allen drei Proteinen erhalten geblieben sind, befinden sich in den schwarzen Bereichen. Reste, die zwischen zwei oder drei der Sequenzen erhalten geblieben sind, sind grau unterlegt. Die 7 erhaltenen Cysteinreste, die für Mitglieder der TGF-β-Familie kennzeichnend sind, werden durch Sternchen oberhalb der Sequenz angezeigt. Die Anzahl der Aminosäurereste ist rechts angegeben. Die Bindestriche zeigen Lücken an, die in die Sequenz eingefügt wurden, um die Alinierung zu optimieren,
  • 3 eine partielle cDNA-Sequenz von Enovin zeigt. Die Konsenssequenz wurde durch PCR-Vervielfältigung (primäre PCR mit den Primern PNHsp1 und PNHap1 und nested-PCR mit den Primern PNHsp2 und PNHap2) erhalten, wobei dieses Verfahren auf verschiedene cDNAs angewendet und wobei anschließend kloniert und eine Sequenzanalyse durchgeführt wurde, um die erhaltenen Sequenzen zu vergleichen. Der translatierte Ein-Buchstaben-Code der Aminosäuresequenz der Nukleotide 30 bis 284 (Leserahmen A) ist oberhalb der Sequenz dargestellt, wobei die Anzahl rechts angegeben ist (A1 bis A85). Dieser Leserahmen enthält ein putatives ATG-Translationsstartcodon. Der translatierte Ein-Buchstaben-Code der Aminosäuresequenz der Nukleotide 334 bis 810 (Leserahmen B) ist oberhalb der Sequenz dargestellt, wobei die Anzahl rechts angegeben ist (B1 bis B159). Dieser Leserahmen enthält einen Homologiebereich mit GDNF, NTN und PSP. Die Anzahl der Nukleotidreste ist rechts von der DNA-Sequenz angegeben. Die putative RXXR-Spaltungsstelle für die Prodomäne ist unterstrichen und fett gedruckt. Der putative Start des ausgereiften Proteins wird durch einen Pfeil angezeigt. Die sieben erhaltenen Cysteinreste, die für sämtliche Mitglieder der TGF-β-Familie kennzeichnend sind, werden durch Fettdruck angezeigt. Eine potenzielle N-Glycosylierungsstelle ist doppelt unterstrichen,
  • 4 die Lokalisierung von menschlichem Enovin auf dem Chromosom zeigt. (A) Diagramm der Ergebnisse der FISH-Analyse für Enovin. Jeder Punkt steht für die doppelten FISH-Signale, die auf dem menschlichen Chromosom 1, Bereich p31.3-p32 nachgewiesen wurden. (B) Beispiel für eine FISH-Analyse von Enovin. Das linke Feld zeigt die FISH-Signale auf Chromosom 1. Das rechte Feld zeigt dieselbe mitotische Figur, die mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol angefärbt wurde, um Chromosom 1 zu identifizieren,
  • 5 die Expression von Enovin in verschiedenen menschlichen Geweben zeigt. (A), (B), (C) Northern Blot-Analyse der Gewebeexpression von Enovin. Die Expression von Enovin-mRNA in verschiedenen menschlichen Geweben wurde unter Verwendung einer Sonde bewertet, welche einem Teil des codierenden Bereichs von Enovin (einschließlich des Bereichs, der für das ausgereifte Enovinprotein codiert) entsprach, und mit Hilfe welcher die Blots von menschlicher RNA mit langem Poly(A)-Schwanz untersucht wurden. (A) Multiple Tissue Northern(MTN)-Blot; (B) MTN-Blot II) Fetal MTN-Blot II. Das Feld (D) zeigt eine Autoradiographie des ursprünglichen Blots der menschlichen RNA, welcher unter Verwendung des gleichen Enovin-cDNA-Fragments als Sonde untersucht wurde. Das Feld (E) zeigt die Lokalisierung von mRNA-Proben aus menschlichem Gewebe auf dem ursprünglichen RNA-Blot aus (D),
  • 6 eine graphische Darstellung der Gesamtüberlebensrate von SH-SY5Y-Zellen nach 72stündiger Behandlung mit 10-6M Taxol ist, die weiterhin die Wirkung zunehmender Dosen von Enovin auf die Überlebensrate zeigt, wobei eine Normalisierung hinsichtlich des Lösemittels erfolgte. Vor der Anwendung von Taxol werden die SH-SY5Y-Zellen 5 Tage lang mit 25nM Staurosporin differenziert. Die Daten stammen aus zwei unabhängigen, sechsfach durchgeführten Versuchen. Es werden der Mittelwert und die Standardabweichung angegeben,
  • 7 eine graphische Darstellung der Wirkung von ansteigenden Konzentrationen von Enovin auf das Ausreifen von Neuriten bei Staurosporin-differenzierten SH-SY5Y-Zellen ist, wobei das Enovin 48 Stunden lang einwirkte und eine Normalisierung hinsichtlich des Lösemittels erfolgte. Vor dem Beginn des 48-stündigen Versuches werden die SH-SY5Y-Zellen 5 Tage lang mit 25nM Staurosporin differenziert. Als positiver Kontrollansatz wird die differenzierende Wirkung von 25nM Staurosporin gezeigt. Die Länge der Neuriten wird für mindestens 5000 Zellen berechnet. Die angegebenen Daten stammen aus Versuchen, die als Doppelansatz durchgeführt wurden. Es werden der Mittelwert und die Standardabweichung angegeben.
  • Bei den 8 bis 18 handelt es sich um graphische Darstellungen der Wirkung von Enovin auf die Proliferation verschiedener Zelltypen.
  • 19 ist eine graphische Darstellung der Wirkungen von Enovin auf taxolinduzierte Mängel in der Sinneswahrnehmung, wobei der Pin-Prick-Test verwendet wird. Es wird der Durchschnittswert (± 1 SEM) der über den Zeitraum hinweg kumulierten Ergebnisse bei Ratten angegeben, welche nach Taxol entweder mit 2 unterschiedlichen Dosen an Enovin (23 oder 130 μg/ml; n = 10 Ratten/Gruppe) oder mit Vehikel/Kochsalzlösung (n = 20 Ratten) behandelt wurden. Von Enovin bzw. Kochsalzlösung/Vehikel wurde jeweils ein Volumen von 75 μl in den subplantaren Bereich der rechten hinteren Pfote injiziert.
  • 20 ist eine graphische Darstellung der Wirkungen von Enovin auf taxolinduzierte Mängel in der Sinneswahrnehmung, wobei der Pin-Prick-Test verwendet wird. Es wird der Durchschnittswert (± 1 SEM) der über den Zeitraum hinweg kumulierten Ergebnisse bei Ratten angegeben, welche vor Taxol entweder mit 2 unterschiedlichen Dosen an Enovin (23 oder 130 μg/ml; n = 10 Ratten/Gruppe) oder mit Vehikel/Kochsalzlösung (n = 20 Ratten) behandelt wurden. Von Enovin bzw. Kochsalzlösung/Vehikel wurde jeweils ein Volumen von 75 μl in den subplantaren Bereich der rechten hinteren Pfote injiziert.
  • 21 ist DNA-Sequenz von Enovin. Die Konsenssequenz wurde durch PCR-Vervielfältigung mit den Primern PNHsp5 und PHNap1 erhalten, wobei dieses Verfahren auf cDNA des menschlichen Frontalkortex sowie auf menschliche genomische DNA angewendet und wobei anschließend kloniert und eine Sequenzanalyse durchgeführt wurde, um die erhaltenen Sequenzen zu vergleichen. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist oberhalb der DNA-Sequenz angegeben, und zwar ausschließlich für die Spleißvariante, die nach Translation zu einem funktionellen Enovinprotein führt. Die Anzahl der Nukleotidreste ist links von der DNA-Sequenz angegeben, während die Anzahl der Aminosäurereste rechts von der translatierten Proteinsequenz angegeben ist. 5'- und 3'-Spleißstellen, die durch Vergleich von sequenzierten cDNA-Fragmenten mit der genomischen Sequenz nachgewiesen wurden, werden durch vertikale Striche, die nach links beziehungsweise nach rechts abknicken, angezeigt und sind fortlaufend nummeriert. Die putative RXXR-Furin-Spaltungsstelle für die Prodomäne ist unterstrichen und fett gedruckt. Der putative Start des ausgereiften Proteins wird durch einen Pfeil angezeigt. Die sieben erhaltenen Cysteinreste, die für sämtliche Mitglieder der TGF-β-Familie kennzeichnend sind, werden durch Fettdruck angezeigt. Eine potenzielle N-gebundene Glycosylierungsstelle ist doppelt unterstrichen. Die 5'- und 3'-Spleißstellen sind nummeriert und eingekreist.
  • 22 ist eine Darstellung der Expression verschiedener Enovin-Spleißvarianten in menschlichen Geweben. (A) Schematisches Diagramm der Enovin- Spleißvarianten, die durch RT-PCR-Versuche mit enovinspezifischen Primern identifiziert wurden, wobei RNA aus verschiedenen menschlichen Gewebe eingesetzt wurde, wobei anschließend kloniert und die PCR-Produkte einer Sequenzanalyse unterzogen wurden. Die obere Linie zeigt eine Skala (in bp). Die zweite Linie stellt die genomischen Sequenzen des Enovins dar. Die Position der Start- und Stopcodons der Translation, des Starts der Sequenz, die für das ausgereifte Enovin codiert sowie der 5'- und 3'-Spleißstellen (siehe 21) ist angezeigt. Der rechte Teil der Figur zeigt die PCR-Produkte, die durch RT-PCR erhalten werden, wobei RNA aus den Eierstöcken und dem Frontalkortex gemeinsam mit einer 100 bp DNA-Leiter eingesetzt wurde. Die Position der verschiedenen mRNA-Varianten ist zusammen mit ihrer Größe (vom Start- bis zum Stopcodon) angegeben. Die translatierten Proteine sind auf der linken Seite dargestellt. In den Kästen befinden sich Bereiche, die in der cDNA vorkommen. Die gestrichelten Linien stehen für herausgespleißte genomische DNA. Der schraffierte Bereich kennzeichnet die Sequenz, die für das ausgereifte Enovin codiert. Die gepunktete Linie kennzeichnet den Start der Sequenz, die für das ausgereifte Enovin codiert. Die beiden Transkripte, mit denen funktionellen Enovinprotein erhalten werden kann, sind auf der linken Seite mit einem Sternchen gekennzeichnet. (B) Gewebeverteilung der Haupt-Spleißvarianten. Die Abbildung zeigt die PCR-Fragment, die durch RT-PCR mit enovinspezifischen Primer-erhalten wurden, wobei verschiedene menschliche cDNAs eingesetzt wurden. Die 4 Haupt-Spleißvarianten (A bis D) sind durch Pfeile auf der linken Seite gekennzeichnet. Auf der rechten Seite sind die Größen angegeben, wobei die 100 bp DNA-Leiter auf dem Gel als Bezugsgröße verwendet wurde.
  • 23: Vorhergesagte Proteinsequenz der langen Spleißvariante von Enovin, die erhalten wurde, indem die beiden Introns aus der DNA-Sequenz der 21 herausgespleißt wurden. Die Spleißstellen 5'1 und 3'-1 werden verwendet, um das erste Intron zu entfernen, und die Spleißstellen 5'-2 und 3'-3 werden verwendet, um das zweite Intron zu entfernen. Diese führt zu einer cDNA-Sequenz mit einem offenen Leserahmen, welche für das Protein mit 228 Aminosäureresten codiert, welches oben gezeigt wird.
  • 24: Vorhergesagte Proteinsequenz einer alternativen (kurzen) Spleißvariante von Enovin, die erhalten wurde, indem die beiden Introns aus der DNA-Sequenz der 21 herausgespleißt wurden. Die Spleißstellen 5'-1 und 3'-2 werden verwendet, um das erste Intron zu entfernen, und die Spleißstellen 5'-2 und 3'-3 werden verwendet, um das zweite Intron zu entfernen. Diese führt zu einer cDNA-Sequenz mit einem offenen Leserahmen, welche für das Protein mit 220 Aminosäurereste codiert, welches oben gezeigt wird. Verglichen mit der Sequenz in 23 fehlen dieser Proteinsequenz 8 Aminosäurereste.
  • 25 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die bei den Versuchen erzielt wurden, die dazu dienten, das Niveau der Expression von Enovin in normalen und erkrankten Geweben zu vergleichen. Es wird die Expression von Enovin und GAPDH in Hirngewebe gezeigt, und zwar bezüglich multipler Sklerose und Alzheimer.
  • 26 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die beim Nachweis des Niveaus der Expression von Enovin und GAPDH bei der Parkinson'sche Krankheit und bei Krebs erzielt wurden.
  • REGISTRIERUNGEN
  • Das Plasmid EVNmat/pRSETB einschließlich der DNA- Sequenz, die für Enovin codiert, wurde am 6. Mai 1999 unter der Registrierungs-Nr. LMBP3931 bei der Belgian Coordinated Collections of Micro-Biologie (BCCM) im Laboratorium voor Moleculaire – Plasmidencollectie (LMBP) B9000, Gent, Belgien gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages vom 28. April 1997 zur Registrierung eingereicht.
  • MATERIAL UND METHODEN
  • Material
  • Native Taq-Polymerase, Ampicillin, IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid), X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) sowie sämtliche der eingesetzten Restriktionsenzyme stammten von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland). Der 10 mM dNTP-Mix wurde bei Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) erworben. Das TOPO-TA Klonierkit wurde bei Invitrogen BV (Leek, Niederlande) erworben. Das Qiagen Plasmid Mini- oder Midi-DNA-Aufreinigungskit, das Qiaprep Spin Miniprep Kit und das Qiaquick Gelextraktionskit wurden bei Qiagen GmbH (Düsseldorf, Deutschland) erworben. Die cDNR-Banken, die MarathonTM Ready cDNA-Kits, die Platten I und II mit menschlicher cDNA aus mehreren Geweben (MTCTM) für die Multiple tissues Northern Blots sowie das Advantage-GC cDNA PCR-Kit wurden bei Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA) erworben. Sämtliche PCR-Reaktionen wurden in einem GeneRmp PCR-System 9600 Zyklusgerät (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Das LB (Luria-Bertani)-Medium besteht aus 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l NaCl. Die 2× YT/Ampicillinplatten bestehen aus 16 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 15 g/l an Agar und 100 mg/l an Ampicillin.
  • Datenbanksuche nach Homologien und Sequenzvergleich
  • Unter Verwendung der Proteinsequenzen, die sich aus der cDNA des vollständigen menschlichen neurotrophen Faktors, der sich aus Gliazell-Linien entwickelt (GDNF; Registrierungs-Nr. Q99748), aus der cDNA von Neurturin (NTN, Registrierungs-Nr. P39905) und aus der cDNA von Persephin (PSP; Registrierungs-Nr. AF040962) ableiten, als Suchsequenzen wurde eine BLAST-Suche (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., 1990) durchgeführt, wobei der humane exprimierte Sequenzmarker (expressed sequence tag, EST) von EMBL/GenBank sowie Genomdatenbanken in täglich aktualisierten Versionen eingesetzt wurden.
  • Zusätzliche BLAST-Suchen wurden unter Verwendung der genomischen Sequenz mit der Registrierungs-Nr. A0005038 sowie mehrerer ESTs, die in der Datenbank von GenBank vorhanden sind und nachweislich Homologie mit dieser genomischen Sequenz zeigen.
  • Die Prozentsätze der Übereinstimmung und der Ähnlichkeit zwischen den Mitgliedern der GDNF-Familie wurde durch paarweisen Vergleich der Sequenzen unter Verwendung des BESTFIT-Programms berechnet (Genetics Computer Group sequence analysis software package, Version 8.0, University of Wisconsin, Madison, WI, USA). Die Alinierungen von DNA- oder Proteinsequenzen erfolgten mit Hilfe des Alinierungsprogramms ClustalW (EMBL, Heidelberg, Deutschland).
  • Oligonukleotidsynthese für die PCR und für die DNA-Sequenzierung.
  • Sämtliche Oligonukleotid-Primer wurden bei Eurogentec (Seraing, Belgien) bestellt. Die insertspezifischen Sequenzierungsprimer (15- und 16-mer) und die Primer zur Verwendung in den PCR-Reaktionen wurden manuell erstellt. Die DNA wurde auf einer Qiagen-Tip-20 oder – 100 Anionenaustausch- oder auf einer Qiaquick Spin- Säule präpariert (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Deutschland) und nach Säulendurchgang in 30 μl TE-Pufferlösung aufgenommen (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA (Natriumsalz), pH 8,0).
  • Die Sequenzierungsreaktionen wurden an beiden Strängen unter Verwendung des ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequenzierungskits vorgenommen, und zwar auf einem Applied Biosystems 377XL Sequenzierungsgerät (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, USA). Die SequencherTM-Software wurde zum Zusammensetzen der Sequenzen und zur deren manueller Bearbeitung eingesetzt (GeneCodes, Ann Arbor, MI, USA).
  • Klonieren eines neuartigen GDNF-Homologons
  • Ein DNA-Bereich, der sich über die Nukleotide 67411 bis 68343 von EMBL Registrierungs-Nr. AC005038 erstreckt und dessen translatierte Proteinsequenz zu ausgereiftem NTN und PSP homolog war, wurde verwendet, um Oligonukleotid-Primer für die PCR-Vervielfältigung zu schaffen. Die verschiedenen verwendeten Primer sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Tabelle 1: Primer, die für die PCR-Vervielfältigung von AC005038-Fragmenten verwendet wurden.
    Figure 00310001
  • Die Primer PNHsp3 und PHNap1 wurden eingesetzt, um ein Fragment von 502 bp auf cDNA, die aus verschiedenen menschlichen Geweben stammte (cDNA aus fötalem Hirn, ganzem Fötus, Prostata oder Marathon-ReadyTM cDNA aus der Lunge (Clontech Laboratories), cDNA aus Frontalkortex, Hippocampus und Kleinhirn) sowie auf menschlicher genomischer DNA zu vervielfältigen. Auf Grundlage der genomischen Sequenz aus der Datenbank von EMBL/GenBank (Reg.-Nr. A0005038) wurde vorhergesagt, dass das zu vervielfältigende Fragment einen G+C-Gehalt von 76 % haben wird. Daher wurden weitere Vervielfältigungen unter Verwendung des Advantage-GC cDNA PCR-Kits (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) vorgenommen, wobei eine Optimisierung für die Vervielfältigung von GC-reichen DNA-Sequenzen erfolgte. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt, welches 1× GC cDNA PCR-Reaktionspuffer, 0, 2 mM dNTP, 1 M GC-MELTTM, 200 nM der Primer PNHsp3 und PHNap1, 1 μl des Advantage KlenTaq Polymerase-Mixes sowie 1 bis 5 μl an cDNA oder 0,5 μg an genomischer DNA enthielt., Die Proben wurden auf 5 min. lang auf 95 °C erhitzt, woraufhin 35 Zyklen von 45 s bei 95 °C, 1 min. bei 58 °C und 40 s bei 72 °C durchgeführt wurden, woraufhin ein Endschritt von 7 min. bei 72 °C folgte. Abschließend wurden die Proben mit 2,5 U an nativer Taq DNA-Polymerase behandelt, um einen A-Überhang anzufügen. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1 % (w/v) Agarosegel in 1× TAE-Puffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA (Natriumsalz), pH 8,3) analysiert. Die PCR-Fragmente der erwarteten Größe (495 bp) wurden aus dem Gel herausgeschnitten und mit dem Qiaquick Gelextraktionskit aufgereinigt. Die PCR-Fragmente wurden sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen und unter Verwendung des TOPO TA-Klonierkits gemäß den Anweisungen des Herstellers durch Klonieren in der Plasmidvektor pCR2.1-TOPO eingefügt. Näherungsweise 20 ng des aufgereinigten Fragments wurden mit 1 μl des Vektors pCR2.1-TOPO in einem Gesamtvolumen von 5 μl kombiniert. Die Reaktionsansätze wurden bei Raumtemperatur (20 °C) 5 min. lang inkubiert. 2 μl der Reaktionsansätze wurden durch Anwendung der Hitzeschocktransformation in TOP10F'-fähige Zellen (Invitrogen BV) hineintransformiert und auf 2× YT/Ampicillin-Platten, denen 10 mM IPTG und 2 (w/v) X-gal für das Blau-Weiß-Screenung zugesetzt wurden, aufgebracht. Nach Wachstum über Nacht wurden die weißen Kolonien von den Platten entnommen und in 5 ml LB-Medium weitergezüchtet, wobei dem Medium 100 mg/l an Ampicillin sowie plasmidische DNA, die unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep-Kits hergestellt wurde, zugesetzt wurde. Das Vorhandensein eines Inserts der erwarteten Größe wurde durch Restriktionsverdauung mit EcoRI bestätigt. Der plasmidische Insert mehrerer positiver Klone wurde sequenziert und die erhaltenen Sequenzen unter Anwendung des Alinierungsprogrammes ClustalW verglichen.
  • Um zusätzliche Codierungssequenzen für das neuartige GDNF-Homologon zu erhalten, wurde ein Fragment mit einer erwarteten Größe von 931 bp, das auf der EMBL/GenBank-Sequenz (Reg.-Nr. A0005038) beruht, durch PCR unter Verwendung der Primer PNHsp1 und PHNap1 vervielfältigt. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt, welches 1× GC cDNA PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTTM, 200 nM der Primer PNHsp1 und PHNap1, 1 μl des Advantage KlenTaq Polymerase-Mixes sowie 1 bis 5 μl an cDNA aus dem Kleinhirn, dem Frontalkortex oder dem Hippocampus oder aber 0,5 μg an genomischer DNA enthielt. Die Proben wurden auf 5 min. lang auf 95 °C erhitzt, woraufhin 35 Zyklen von 45 s bei 95 °C, 1 min. bei 58 °C und 1 min. 30 s bei 72 °C durchgeführt wurden, woraufhin ein Endschritt von 7 min. bei 72 °C folgte. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1 % (w/v) Agarosegel in 1× TAE-Puffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA (Natriumsalz), pH 8,3) analysiert. Es wurde eine zweite Vervielfältigungsrunde mit nested-Primern (PNHsp2 und PNHap2) durchgeführt. 1 μl des Reaktionsansatzes der ersten Vervielfältigungsrunde wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl eingesetzt, wobei letzteres 1× GC cDNA PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELT, 200 nM der Primer PNHsp2 und PHNap2 sowie 1 μl des Advantage KlenTaq Polymerase-Mixes enthielt. Die Proben wurden auf 5 min. lang auf 95 °C erhitzt, woraufhin 35 Zyklen von 45 s bei 95 °C, 1 min. bei 58 °C und 1 min. 30 s bei 72 °C durchgeführt wurden, woraufhin ein Endschritt von 7 min. bei 72 °C folgte. Die Proben wurden auf einem 1 % (w/v) Agarosegel in 1× TAE-Puffer analysiert. Die PCR-Fragmente der erwarteten Größe (870 bp) wurden aus dem Gel herausgeschnitten und mit dem Qiaquick Gelextraktionskit aufgereinigt. Die PCR-Fragmente wurden sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen, mit 2,5 U an Taq Polymerase behandelt und unter Verwendung des TOPO TA-Klonierkits gemäß den Anweisungen des Herstellers durch Klonieren in der Plasmidvektor pCR2.1-TOPO eingefügt. Näherungsweise 20 ng des aufgereinigten Fragments wurden mit 1 μl des Vektors pCR2.1-TOPO in einem Gesamtvolumen von 5 μl kombiniert. Die Reaktionsansätze wurden bei Raumtemperatur (20°C) 5 min. lang inkubiert. 2 μl der Reaktionsansätze wurden durch Anwendung der Hitzeschocktransformation in TOP10F'-fähige Zellen hineintransformiert und auf 2× YT/Ampicillin-Platten, denen 10 mM IPTG und 2 % (w/v) X-gal für das Blau-Weiß-Screening zugesetzt wurden, aufgebracht. Nach Wachstum über Nacht wurden die weißen Kolonien von den Platten entnommen und in 5 ml LB-Medium weitergezüchtet, wobei dem Medium 100 mg/l an Ampicillin sowie plasmidische DNA, die unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep-Kits hergestellt wurde, zugesetzt wurde. Das Vorhandensein eines Inserts der erwarteten Größe wurde durch Restriktionsverdauung mit EcoRI bestätigt. Der plasmidische Insert mehrerer positiver Klone wurde sequenziert und die erhaltenen Sequenzen unter Anwendung des Alinierungsprogrammes ClustalW verglichen.
  • Untersuchung der Genexpression von Enovin mittels RT-PCR-Analyse
  • Die Oligonukleotid-Primer PNHsp3 und PHNap1 (siehe Tabelle 1) wurden für die spezifische PCR-Vervielfältigung eines 502 bp Fragments von Enovin verwendet. Die PCR-Vervielfältigungen wurden auf Platten mit cDNA aus mehreren menschlichen Geweben (MTCTM) durchgeführt, wobei eine Normalisierung mit Bezug auf die mRNA-Expressionsniveaus von sechs verschiedenen Haushaltsgenen erfolgte. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt, welches 5 μl cDNA, 1× GC cDNA PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTTM, 400 nM der Primer PNHsp3 und PHNap1 sowie 1 μl des Advantage KlenTaq Polymerase-Mixes enthielt. Die Proben wurden auf 30 s lang auf 95 °C erhitzt, woraufhin 35 Zyklen von 30 s bei 95 °C und 30 s bei 68 °C durchgeführt wurden. Die Proben wurden auf einem 1,2 % (w/v) Agarosegel in 1× TAE-Puffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA (Natriumsalz), pH 8,3) analysiert und unter Verwendung eines Eagle Eye II Videosystems (Stratagene, La Jolla, CA, USA) wurden Bilder des Gels, das mit Ethidiumbromid angefärbt wurde, erhalten.
  • Bei der Suche nach Ähnlichkeiten mit menschliche Neurturin- und Persephinproteinsequenzen in der täglich aktualisierten Datenbank von EMBL/GenBank wurde eine genomische DNA-Sequenz gefunden, die für ein putatives neuartiges Protein codiert, welches den neurotrophen Faktoren GDNF, NTN und PSP ähnlich ist und welches Enovin (EVN) genannt wurde. Wenn bei der Suche nach zusätzlichen Datenbankhomologien die genomische DNA-Sequenz, die beidseitig unmittelbar in der Nähe des Bereiches, der für Enovin codiert, herum gelegen ist, verwendet wird, werden mehrere Klone von exprimierten Sequenzmarkern (expressed sequence tag, EST) aus verschiedene menschlichen Geweben gefunden (Prostataepithel [Registrierungs-Nr. AA533512 (ID1322952)], Lungenkarzinom [Registrierungs-Nr. AA931637] und Tumor der Nebenschilddrüse [Registrierungs-Nr. AA844072]). Diese Klone enthalten DNA-Sequenzen, die sich außerhalb des Homologiebereiches mit GDNF, PSP oder NTN befinden, aber sie bestätigten, dass die Enovin-mRNA in normalem wie in Tumorgewebe exprimiert wird.
  • Bei der erstmaligen PCR-Vervielfältigung unter Verwendung von Primern (PNHsp3 und PHNap1) auf Basis der genomischen Sequenz wurde ein Fragment von ungefähr 500 bp bei Einsatz cDNA aus Fötus, fötalem Hirn, Prostata, Frontalkortex, Hippocampus und Kleinhirn sowie bei Einsatz von genomischer DNA erhalten, nicht jedoch bei Einsatz von cDNA aus der Lunge. Das Klonieren und die Sequenzanalyse dieser Fragmente ergaben eine DNA-Sequenz von 474 bp, welche der Vorhersage entsprechend zu einer Proteinsequenz aus 139 Aminosäureresten einschließlich der sieben erhaltenen Cysteinreste, die für sämtliche Mitglieder der Proteinfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren (1) (TGF-β) (Kingsley, 1994) kennzeichnend sind, translatiert wird. (1) Die Sequenz enthielt weiterhin ein RXXR-Motiv zur Spaltung der Prodomäne (RAAR, Aminosäurepositionen 23 bis 26) (Barr, 1991). Eine ähnliche Spaltungsstelle befindet sich in den Proteinsequenzen von GDNF, NTN und PSP, und zwar in einer vergleichbaren Position in der Prodomänensequenz. Unter der Annahme, dass in vivo an dieser Stelle eine Spaltung der Enovin-Prodomäne stattfindet, enthält die ausgereifte EVN-Proteinsequenz 113 Aminosäurereste (Reste 27 bis 139 in 1), und sie hat eine berechnetes Molekulargewicht von 11965 Da sowie einen isoelektrischen Punkt von 11,8. Die ausgereifte Sequenz (NST bei Aminosäurepositionen 121 bis 123) weist eine potenzielle N-Glycosylierungsstelle auf. Darüber hinaus sind mehrere Bereiche, die zwischen den ausgereiften Formen der bekannten neurotrophen Faktoren GDNF, NTN und PSP erhalten bleiben, auch in Enovin vorhanden (2). In Tabelle 2 sind die Ergebnisse des Vergleichs der ausgereiften Proteinsequenzen der Mitglieder der GDNF-Familie mittels des BESTFIT-Progamms aufgeführt. Es werden die Prozentwerte der Übereinstimmung und der Ähnlichkeit gezeigt. Die ausgereiften Sequenzen von GDNF, NTN, PSP und EVN, die in diesem Vergleich verwendet werden, beginnen beim ersten Aminosäurerest, der auf die RXXR-Spaltungsstelle folgt.
  • Tabelle 2: Paarweiser Vergleich der ausgereiften Mitglieder der menschlichen GDNF-Familie mittels des BESTFIT-Programms.
    Figure 00370001
  • Aus diesen Vergleichen geht hervor, dass das ausgereifte Enovinprotein enger mit Persephin und mit Neurturin verwandt ist als mit GDNF.
  • Durch Vervielfältigung, Klonieren und Sequenzanalyse eines größeren Fragments aus der DNA-Sequenz von Enovin aus cDNA des Frontalkortex unter Verwendung von Primern auf Basis von der genomischen EMBL/GenBank-Sequenz (Reg.-Nr. AC005038) wurde eine Sequenz mit 819 bp (3) erhalten. Diese Sequenz enthält bei den Nukleotidpositionen 30 bis 32 ein putatives ATG-Startcodon und führt zu einem offenen Leserahmen (Leserahmen A in 3), der sich bis zu einem Stopcodon bei den Nukleotidpositionen 285 bis 287 erstreckt. Die translatierte Proteinsequenz dieses Bereiches zeigt keinerlei Ähnlichkeit mit Proteinen, die aus den Datenbanken bekannt sind. Bei der Translation der cDNA-Sequenz im zweiten Leserahmen (Leserahmen B in 3) wird eine vorhergesagte Proteinsequenz mit 159 Aminosäureresten erhalten. Diese Sequenz enthält die RXXR-Spaltungsstelle (Position B43 bis B46; Nukleotidposition 460 bis 471) sowie die Sequenz, welche der ausgereiften Enovinsequenz (Position B47 bis B159; Nukleotidposition 472 bis 810) entspricht. Der offene Leserahmen einschließlich der RXXR-Spaltungsstelle und der Sequenz, die für das ausgereifte Enovin codiert, erstreckt sich zwischen der Nukleotidposition 334 (der innerhalb des Rahmens ein Stopcodon vorangeht) und dem Stopcodon bei der Position 811 bis 813, aber er enthält kein ATG-Codon für Methioninrest mit Startfunktion. In Analogie mit Persephin (Milbrandt et al., 1998) nehmen wir an, dass die Mehrheit der mRNA-Transkripte des EVN-Gens ein ungespleißtes Intron aufweist. GDNF und NTN weisen ebenfalls ein Intron in ihren jeweiligen Bereichen, die für die Prodomäne codieren, auf (Matsushita et al., 1997, Heuckeroth et al., 1997).
  • Um das Vorhandensein verschiedener mRNA-Transkripte für Enovin zu bewerten, wurden RT-PCR-Versuche unter Verwendung von Primern, die am 5'-Ende der Sequenz, die für Enovin codiert, gelegen sind, und zwar nur 5' von einem möglichen strangaufwärts gerichteten ATG-Startcodon entfernt (Primer PNHsp5 [5'-GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G-3'] sowie der nested-Primer PNHsp6 [5'-GGT GGG GGA ACA GCT CAA CAA TGG-3']), und die am 3'-Ende gelegen sind (Primer PNHap1 und nested-Primer PNHap2 [siehe Tabelle 1]). Die Versuche wurden auf Platten mit cDNA aus mehreren menschlichen Geweben (Clontech MTC-Platten I und II) unter Einsatz einer Datenbank von cDNA aus dem fötalen Herzen und einer cDNA, die aus dem menschlichen Kleinhirn, Hippocampus stammt oder Frontalkortex stammt (Masure et al., 1998) durchgeführt. Erstmalige PCR-Reaktionen wurden mit den Primern PNHsp5 und PHNap1 unter GC-reichen Bedingungen (Advantage GC-PCR-Kit, Clontech) über 30 Zyklen (95 °C – 30 s, 60 °C – 30 s, 72 °C – 1 min.) wie beschrieben durchgeführt. Nested-PCR-Reaktionen wurden unter Einsatz von 1 μl des Produktes der erstmaligen PCR unter Verwendung der Primer PNHsp6 und PNHap2 unter den gleichen Bedingungen über 30 Zyklen durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden auf 1,5 %igem Agarosegel analysiert und bewegten sich in der Größenordnung von ± 350 bp bis ± 800 bp. Mehrere Banden wurden aus dem Gel auf gereinigt, woraufhin die PCR-Fragmente direkt sequenziert wurden. Einige aufgereinigte PCR-Produkte wurden darüber hinaus in den Vektor pCR2.1-TOPO kloniert (TOPO-TA Klonierkit, Invitrogen) und dann sequenziert. Die Sequenzanalyse bestätigte das Vorhandensein von unterschiedlichen mRNA-Molekülen, welche die Enovinsequenz enthalten. Die erhaltenen Fragmentsequenzen wurden mit der genomischen Enovinsequenz verglichen. Dies hat es und ermöglicht, mehrere mögliche 5'- und 3'-Spleißstellen in der genomischen Sequenz (21) zu identifizieren. Sämtliche dieser Spleißstellen entsprechen den Konsenssequenzen für Donator- und Akzeptorspleißstellen (Senapathy, P., Shapiro, M.B. & Harris, N.L. (1990)) splice junctions, branch point sites, and exons: sequence statistics, identification, and applications to genome project. Methods Enzymol. 183,252–278). Die unterschiedlichen identifizierten Spleißvarianten des Enovins und ihr Vorhandensein ein verschiedenen menschlichen Geweben sind zusammenfassend in 22 dargestellt. Nur zwei der 5 sequenzierten Transkripte führen bei der Translation, ausgehend vom ATG Startcodon, zu funktionellem Enovinprotein. Diese beiden Transkripte codieren für Proteine mit 228 beziehungsweise 220 Aminosäuren, mit den vorhergesagten Signalpeptiden mit 47 und 39 Aminosäureresten. Die vorhergesagten Proteinsequenzen dieser beiden Varianten sind in 23 (lange Variante) und in 24 (kurze Variante) dargestellt. Die lange Variante kann aus der DNA-Sequenz von 21 hergeleitet werden, indem das erste Intron an den Stellen 5'-1 und 3'-1 und das zweite Intron bei 5'-2 und 3'-3 herausgespleißt werden. Bei Translation des offenen Leserahmens wird die vorhergesagte Proteinsequenz aus 23 erhalten. Die kürzere Variante kann aus der DNA-Sequenz von 21 hergeleitet werden, indem das erste Intron an den Stellen 5'-1 und 3'-2 und das zweite Intron bei 5'-2 und 3'-3 herausgespleißt werden. Bei Translation des offenen Leserahmens wird die vorhergesagte Proteinsequenz aus 24 erhalten.
  • Das längste Transkript scheint in den meisten Geweben häufiger vorzukommen, wie aus der Intensität der Bande in 22B zu entnehmen ist. Die kürzeren Transkripte führen die Rahmenverschiebungen, infolge derer ein translatiertes Protein erhalten wird, dem diejenige Aminosäuresequenz des ausgereiften Enovins, welche mit GDNF, NTN und PSP homolog ist, fehlt. Den beiden kleinsten Transkripten fehlt sogar eine Sequenz, die für Teile der ausgereiften Form codiert, einschließlich zweier der sieben in starkem Ausmaße erhaltenen Cysteinreste. 22B zeigt die Verteilung der Haupt-Spleißvarianten in verschiedenen menschlichen Geweben. Die funktionelle Enovin-mRNA wird in fast allen untersuchten Geweben exprimiert, einschließlich des Gehirns, des Herzens, der Nieren, der Leber, der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, der Skelettmuskulatur, des Dickdarms, des Dünndarms, der peripheren Blutleukozyten, der Milz, des Thymus, der Prostata, der Hoden, der Eierstöcke, der Plazenta und des fötalen Herzens. In einigen menschlichen Geweben (z.B. Kleinhirn, Hippocampus) konnten nur nicht-funktionelle Transkripte mittels PCR vervielfältigt werden. Soweit uns bekannt ist, wurde das Vorkommen von nicht-funktionellen mRNA-Transkripten in einem solchen Ausmaß bislang noch nicht beschrieben. Die biologische Bedeutung dieser Entdeckung muss noch untersucht werden. Obgleich die Expression von NTN und PSP in verschiedenen Geweben noch nicht vollständig beschrieben wurde, scheint das Niveau ihrer jeweiligen Expression viel geringer zu sein und die Expression in stärkerem Ausmaße auf bestimmte Gewebe beschränkt zu sein (Kotzbauer et al., 1996, Milbrandt et al., 1998).
  • Rekombinante Expression von Enovin in einer E. coli Konstruktion eines Enovin-Expressionsplasmids
  • Ein 414 bp PCR-Fragment wurde aus der menschlichen genomischen DNA mit den Primern PNHsp4 und PNHap2 (Tabelle 1) vervielfältigt und unter Verwendung von TA-cloning (Invitrogen) in den Vektor pCR2.1-TOPO kloniert. Die Sequenz des Inserts wurde durch Sequenzanalyse bestätigt. Ein Klon, der ein Insert mit der Konsenssequenz des Enovins enthält (Klon 36), wurde zur anschließenden Konstruktion eines Expressionsplasmids verwendet. Es wurden zwei Primer erstellt, die an ihren 5'-Enden geeignete Restriktionsstellen aufweisen. Der Vorwärtsprimer PNHexp-sp1 (5'- GCG GAT CCG GCT GGG GGC CCG GGC A -3') enthielt eine Restriktionsstelle (unterstrichen) für BamHI und der Rückwärtsprimer PNHexp-ap1 (5'- GCC TCG AGT CAG CCC AGG CAG CCG CAG G -3') enthielt eine Restriktionsstelle (ebenfalls unterstrichen) für XhoI. Unter Verwendung dieser Primer wurde das 343 bp Fragment, welches für ausgereiftes Enovin codiert (Position 81 bis 422 in 1) aus dem Klon 36 vervielfältigt. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt, welches 1× GC cDNA PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 1 M GC-MELTTM, 200 nM der Primer PNHexp-sp1 und PNHexp-ap1, 1 μl des Advantage KlenTaq Polymerase-Mixes sowie 10 ng an plasmidischer DNA aus dem Klon 36 enthielt. Die Proben wurden auf 5 min. lang auf 94 °C erhitzt, woraufhin 25 Zyklen von 45 s bei 94 °C, 1 min. bei 58 °C und 30 s bei 72 °C durchgeführt wurden, woraufhin ein Endschritt von 7 min. bei 72 °C folgte. Die erhaltenen 50 μl an Produkt wurden unter Verwendung des Qiaquick PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt und die DNA in 30 μl eluiert. 25 μl dieses aufgereinigten Produktes wurden anschließend in einem Reaktionsansatz von 30 μl mit 10 U an BamHI und 10 U an XhoI in 1× Puffer B (Boehringer Mannheim) eine Stunde lang bei 37 °C verdaut. Nach Elektrophorese in einem 1 %igen (w/v) Agarosegel in 1× TAE-Puffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA (Natriumsalz), pH 8,3) wurde die erwartete 353bp Bande aus dem Gel herausgeschnitten und mit Hilfe des Qiaquick Gelextraktionskits aufgereinigt. Das erhaltene Fragment wurde in den Vektor pRSET B (Invitrogen) ligiert, der mit BamHI und Xhol linearisiert wurde. Das Insert des erhaltenen Plasmid-Konstrukts (hEVNmat/pRSETB) wurde durch eine vollständige Sequenzanalyse bestätigt. Das erhaltene Konstrukt codiert für ein Protein aus 146 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 15704 Da einschließlich eines NH2-endständigen 6× His-Markers, der innerhalb der Rahmens mit der Sequenz, die für das ausgereifte Enovin codiert, verschmolzen ist. Die NH2-endständige Aminosäuresequenz des erhaltenen Proteins lautet daher MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPAGGPGS (ausgereifte Enovinsequenz im Fettdruck, 6× His-Marker unterstrichen).
  • Expression von Enovin in BL21 (DE3) E.coli Zellen
  • Die rekombinante Herstellung des Enovinprotein wurde im Wesentlichen derart durchgeführt, wie Creedon et al. (1997) es für Neurturin beschrieben haben, wobei aber Modifizierungen vorgenommen wurden. Für die Herstellung von rekombinantem Enovinprotein wurde das Plasmid hEVNmat/pRSETB in den E. coli Stamm BL21(DE3) (Novagen) transformiert, welcher in 2×YT/Ampicillinmedium (16 g/l Trypton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l an NaCl and 100 mg/l an Ampicillin) bei 30 °C (225 U/min.) oder bei 37°C (300 U/min.) bis zu einer OD600 von näherungsweise 0,5 herangezüchtet wurde, bevor IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM zugesetzt wurde, um die Expression zu einzuleiten. Durch Zentrifugation mit anschließender 3stündiger Induktionsphase wurden Zellpellets gewonnen, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, zentrifugiert und gefroren gelagert wurden. Für die Aufreinigung und Neufaltung wurden die Zellpellets in Ultraschallpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, Proteaseinhibitoren (CompleteTM Proteaseinhibitorcocktail in Tablettenform (Boehringer Mannheim, 1 Tablette auf 50 ml Puffer)) und 1 mg Lysozym pro 500 mg Zellpellets) wieder in Suspension gebracht. Die Zellen wurden durch Ultraschall aufgebrochen und die Einschlusskörper durch Zentrifugation gewonnen. Die Einschlusskörper wurden in Puffer A (8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 7, 6, 200 mM NaCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol) in Lösung gebracht und 30 min. lang bei 37 °C inkubiert, bevor sie auf Ni-NTA-Harz (Nickelnitriltriessigsäure, Qiagen) gegeben wurden. Nach 40minütigem Schütteln bei 37 °C wurden die Proben einmal mit Puffer A gewaschen und auf eine 5 ml Ni-NTA-Säule gegeben. Die Säule wurde nacheinander mit 10 Säulenvolumina an Puffer A, 10 Säulenvolumina an Puffer A mit einem pH-Wert von 7,2 und mit 10 Säulenvolumina an Puffer A mit einem pH-Wert von 7,2 und einem Zusatz von 10 mM Imidazol gewaschen. Das Enovin wurde in 4 Säulenvolumina an Puffer A mit einem pH-Wert von 7,2 und einem Zusatz von 200 mM Imidazol von der Säule eluiert.
  • Die Neufaltung des Enovin erfolgte durch schrittweise Übernachtdialyse bei 4°C in Renaturierungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, 3 μM Cystein, 0,02 Tween-20, 10 % Glycerin, 0,01 M Tris-HCl, pH 8,3), welcher eine Menge an Harnstoff enthielt, die bei jedem Schritt abnahm (von 6 M auf 4 M auf 3 M auf 2 M auf 1 M auf 0,5 M bis auf 0 M an Harnstoff). Von dem auf gereinigten Protein wurde Aliquote abgenommen, die bei –20 °C gelagert im Weiteren für funktionelle Assays verwendet wurden.
  • Lokalisierung des Enovingens auf dem Chromosom
  • Ein 3,3 kb Fragment des Enovingens wurde aus Kleinhirn-cDNA vervielfältigt, und zwar unter Verwendung der Primer EVN (7) – sp1 (5 ' – TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC -3') und PNHap1 (5'- GCA GGA AGA GCC ACC GGT AAG G – 3'), welche anhand der Sequenz mit der EMBL-Registrierungsnummer AC005038 erstellt wurden. Die PCR-Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt, das 1× Expand Long Template PCR-Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim), 0,5 mM dNTP, 1 M GC-MELT (Clontech Laboratories), 400 nM der Primer EVN(7)-sp1 and PNHap1 sowie 1 μl an Kleinhirn-cDNA enthielt. Nach einer Anfangszeit 2 min. bei 94 °C wurden 0,75 μl an Expand Long Template Polymerase (Boehringer Mannheim) zugesetzt, woraufhin 10 Zyklen von 10 s bei 94 °C, 30 s bei 58 °C und 3 min. bei 68 °C durchgeführt. Anschließend wurden 20 weitere Zyklen durchgeführt, wobei die Extensionszeit bei 68 °C bei jedem Zyklus um 20 s verlängert wurde. Abschließend wurde die Temperatur von 68 °C 7 min. lang gehalten. Das erhaltene 3,3 kb Fragment wurde nach Elektrophorese in 0,8 %igem Agarose/TAE-Gel aufgereinigt und unter Verwendung von TA-cloning (Invitrogen) in den Vektor pCR2.1-TOPO kloniert. Die vollständige Sequenzanalyse des 3,3 kb Inserts eines Klons bestätigte, dass die erhaltene cDNA-Sequenz der genomischen Sequenz in der EMBL-Datenbank (Registrierungsnummer AC005038) entspricht. In der cDNA, die aus Kleinhirn-cDNA gewonnen wurde, wurden keinerlei Introns herausgespleißt.
  • Es wurden Untersuchungen zur chromosomalen Kartierung unter Anwendung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) durchgeführt, und zwar im Wesentlichen gemäß vorliegender Beschreibungen (Heng et al., 1992, Heng & Tsui, 1993). Menschliche Lymphozyten wurden bei 37 °C 68 bis 72 Std. lang herangezüchtet, um dann mit 0,18 mg/ml an 5-Bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) zur Synchronisation der Zellzyklen innerhalb des Zellbestandes behandelt zu werden. Die synchronisierten Zellen wurden gewaschen und bei 37 °C 6 Std. lang weitergezüchtet. Die Zellen wurden entnommen und unter Verwendung von Standardverfahren einschließlich der hypotonischen Behandlung, der Fixierung und der Lufttrocknung auf transparente Trägerplatten aufgebracht. Die 3,3 kb Sonde für Enovin wurde biotinyliert und für die FISH-Detektion verwendet. Die Trägerplatten wurden bei 55 °C 1 Std. lang erhitzt, mit Rnase behandelt und in 70 %igem Formamid in 2× NaCl/Cit 2 Std. lang bei 70 °C denaturiert (wobei 20× NaCl/Cit 3 M NaCl, 0,3 M Dinatriumcitrat, pH 7,0 entspricht), worauf eine Dehydratation mit Ethanol erfolgte. Die Sonde wurde denaturiert, bevor sie auf die Trägerplatten mit dem denaturierten Chromosomenmaterial gegeben wurde. Nach Hybridisierung über Nacht wurde die Trägerplatten gewaschen und die FISH-Signale sowie das Muster der 4',6-Diamidino-2-phenylindol-Banden getrennt voneinander auf photographischem Film aufgezeichnet, woraufhin durch Überlagerung der FISH-Signale und der Chromosomen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol-Banden die Daten der FISH-Kartierung den chromosomalen Banden zugeordnet werden konnten (Heng & Tsui, 1993). Unter den angewendeten Bedingungen betrug für diese Sonde der Wirkungsgrad der Hybridisierung näherungsweise 72 (von 100 überprüften mitotischen Figuren zeigten 72 Signale auf einem Chromosomenpaar). Da die Bandenmarkierung 4',6-Diamidino-2-phenylindol eingesetzt wurde, um das spezifische Chromosom zu identifizieren, konnte das Signal der Sonde dem kurzen Arm des Chromosoms 1 zugeordnet werden. Die genaue Position wurde im Weiteren bestimmt, indem 10 photographische Aufnahmen zusammenfassend ausgewertet wurden (4A). Unter den angewendeten Bedingungen zeigte die FISH-Detektion keinerlei weitere Fundstelle an, woraus wir schließen, dass Enovin auf dem menschlichen Chromosom 1 im Bereich p31.3-p32 lokalisiert ist. Ein Beispiel für die Ergebnisse der Kartierung ist in 4B dargestellt.
  • Aus den Genkartierungsdaten des National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap) kann abgeleitet werden, dass der genomische Klon, der die Enovinsequenz enthält (EMBL Registrierungsnummer AC005038) auf dem Chromosom 1 zwischen den Markern D1S2843 und D1S417 lokalisiert ist. Dies entspricht dem Bereich p31.1 bis p32.3 des Chromosoms 1, was die Ergebnisse der FISH-Analyse bestätigt.
  • Verteilung des Enovins im Gewebe, bestimmt mittels Northern Blot und Dot-Blot-Untersuchung
  • Northern Blots, die 2 μg an Poly(A)-reicher RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben enthielten (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA; MTNTM blot, MTNTM blot II und Fetal MTNTM blot II), wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem 897 bp Enovinfragment (das mit Random-priming α-32P-dCTP (HighPrime kit, Boehringer Mannheim) markiert ist) hybridisiert. Dieses Fragment wurde durch PCR-Vervielfältigung mit den Primern PNHsp1 und PNHap1 erhalten, wobei cDNA aus dem Frontalkortex eingesetzt und anschließend in den Vektor pCR2.1-TOPO kloniert wurde. Das Fragment enthält 897 bp der Enovinsequenz bis zum Stopcodon und umfasst die vollständige Codierungssequenz für das ausgereifte Enovinprotein.
  • Als hauptsächliches Transkript wurde die Enovin-mRNA mit näherungsweise 4,5 kb (5A–C) nachgewiesen. Die Enovin-mRNA wurde in einer Reihe von Geweben exprimiert, am deutlichsten im Herzen, in der Skelettmuskulatur, in der Bauchspeicheldrüse und in der Prostata. Einige kleinere Transkripte kommen in der Plazenta vor (4 kb, 2,4 kb und 1,6 kb) sowie in der Prostata (4 kb und 1,6 kb). Bei fötalem Gewebe kommt in der Leber recht deutlich ein 2,4 kb Transkript vor, in geringerem Ausmaße auch in der Lunge. Weitere Transkripte kommen darüber hinaus in fötalen Geweben aus der Nieren, der Leber, der Lunge und dem Hirn vor.
  • Zusätzlich dazu wurde ein ursprünglicher RNA-Blot (Clontech Laboratories), der poly(A)-reiche RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben und in verschiedenen Entwicklungsstadien enthielt, mit der 897 bp Enovinsonde hybridisiert. Die poly(A)-reichen RNA-Proben, die zur Erstellung dieses Blot verwendet wurden, sind vom Hersteller mit Bezug auf die MRNA-Expressionsniveaus von acht verschiedenen Haushaltsgenen normalisiert worden. Die Enovin-mRNA wurde ubiquitär exprimiert, wobei indes die höchsten mRNA-Niveaus in der Prostata, der Hirnanhangdrüse, der Luftröhre, der Plazenta, der fötalen Lunge, der Bauchspeicheldrüse und in den Nieren (5D + E) beobachtet wurden.
  • Konstruktion von GFRα-IgG-Fc Fusionsvektoren
  • Die cDNA-Bereiche GFRα-1, GFRα-2 und GFRα-3 (die für die Aminosäuren 27 bis 427, 20 bis 431 beziehungsweise 28 bis 371 codieren) wurden unter Ausschluss der Sequenzen, die für das Signalpeptid und für den COOH-endständige hydrophoben Bereich, der bei der GPI- Verankerung mitwirkt, codieren, in den Expressionsvektor Signal pIG plus (R&D Systems Europe Ltd) kloniert, und zwar innerhalb des Rahmens. Die erhaltenen Proteine, die von diesen Konstrukten exprimiert werden, enthalten ein NH2-endständiges CD33 Signalpeptid mit 17 Aminosäuren, den GFRα-Proteinbereich sowie eine COOH-endständige menschliche IgG1-Fc Fusionsdomäne mit 243 Aminosäuren. CHO-Zellen wurden mit GFRα-Fusionskonstrukten transfiziert, woraufhin stabil transfizierte Zellen unter Verwendung von 500 μg G418 selektiert wurden. Permanente Klone wurden unter Verwendung des anti-Fc Antikörpers selektiert. Zur Aufreinigung der GFRα-Fusionsproteine wurden Zellen in serumfreiem Medium herangezüchtet, wobei das Medium jeweils im Abstand von 3 Tagen entnommen wurde. Das Medium wurde zentrifugiert und auf eine Protein-A-Säule (Protein A Sepharose, Pharmacia Biotech) gegeben. Gebundenes Protein wurde mit 0,1 M Na-Citrat, pH 3,0, eluiert und in 1 M Tris-Puffer, pH 8,4 aufgenommen. Die Proteinkonzentration wurde anhand der Absorption bei 280 nm unter Anwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,5 geschätzt. Diese aufgereinigt löslich GFRα-1 bis -3 Fc-Fusionsprotein wurden im Anschluss für Bindungsuntersuchungen verwendet.
  • Oberflächenplasmonresonanz-Analyse
  • Die Versuche zur Oberflächenplasmonresonanz (SPR) wurden bei 25°C unter Verwendung eines BIAcore 3000 Geräts durchgeführt. Die Analysen wurden mit Enovin und NGF als immobilisierten Liganden durchgeführt. Die carboxylierte Matrix eines F1-Sensorchips wurde zuerst mit einer 1:1-Mischung aus 400 mM N-Ethyl-N-(Dimethylaminopropyl)-carbodiimid und 100 mM N-Hydroxysuccinimid 10 min. lang aktiviert. Anschließend wurden das rekombinante Enovin sowie NGF in 10 mM Acetatpuffer, pH 4,5 mit einer Flussrate von 5 μl/min. auf die aktivierte Oberfläche gegeben. Unbesetzte reaktive Gruppen wurden mit 1 M Ethanolaminhydrochlorid inaktiviert. Für die Bindungsuntersuchungen wurde lösliches GFRα1-3-Fc bei Konzentrationen von 10 bis 100 nM in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (150 mM NaCl, 3,5 mM EDTA, 0,05 % P-20, 10 mM HEPES, pH 7, 4) superfundiert, und zwar bei einer Flussrate von 10 μl/min. Der Zusammenschluss wurde 3 min. lang beobachtet und die Dissoziation 1 min. lang, woraufhin mit 5m NaOH regeneriert wurde. Die Dissoziation wurde durch Superfusion mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung ausgelöst. Es wurde eine Auswertungssoftware, Version 3.0, von BIAcore verwendet, um die Zusammenschlussrate (ka), die Dissoziationsrate (kd) und die Dissoziationskonstante im Gleichgewicht (KD berechnet as kd/ka) zu berechnen.
  • Ergebnisse
  • Die Messung des Bindungsverhaltens von löslichem GFRα1-3 gegenüber immobilisiertem Enovin erfolgt mittels SPR. Eine spezifische Bindung von Enovin konnte nur mit dem löslichen GFRα3 nachgewiesen werden. GFRα1 und GFRα2 banden nicht an das immobilisierte Enovin. Die beobachtete Bindung von GFRα3 war spezifisch, da keine Bindung an NGF auftrat. In einem separat durchgeführten Kontrollversuch wurde die spezifische Bindung von TrkA-Fc (NGF-Rezeptor) an immobilisiertes NGF nachgewiesen, ohne dass dabei eine Bindung an das immobilisierte Enovin auftrat.
  • Aus den Bindungskurven, die bei Verwendung dreier verschiedener Konzentrationen an GFRα erhalten wurden, konnten die im Folgenden in Tabelle 3 aufgeführten Konstanten abgeleitet werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass GFRα3 spezifisch an Enovin bindet.
  • Tabelle 3
    Figure 00500001
  • Da GDNF, NTN und PSP alle den Fortbestand und das Überleben verschiedener Arten von Nervenzellen fördern, wird angenommen, dass Enovin ähnliche biologische Wirkungen auf Nervenzellen sowie möglicherweise auch auf andere Zellarten ausübt. Daher ist es vorstellbar, dass das Enovinprotein bei der Behandlung von nervlichen Störungen im Allgemeinen, einschließlich der Parkinson'sche Krankheit, Alzheimer, peripherer Neuropathie, amyotropher Lateralsklerose, der Huntington-Krankheit, akuter Gehirnverletzungen, Tumoren des Nervensystem, multipler Sklerose, des peripheren Nerventraumas oder einer entsprechenden Verletzung sowie der Einwirkung von Neurotoxinen von Nutzen ist.
  • Enovin könnte auch bei verschiedenartigen Aspekten der Neuroprotektion von Nutzen sein. Angesichts seiner Wirkungen auf das Überleben von verschiedenen Nervenzellbeständen und des beobachteten Längenzunahme bei Neuriten in unseren Modell aus SHSY5Y-Zellen, schlagen wir vor, dass diese Verbindung neuroprotektive und neuroregenerative Anwendungen finden könnte.
  • Dies basiert auf den folgenden Beobachtungen. Taxol induziert in NGF-differenzierten PC12 Pheochromozytomzellen der Ratte neuronale Apoptose (Nuydens et al, eingereicht). Daher weist taxolinduzierte Zytotoxizität Eigenschaftsmerkmale der neuronalen Apoptose auf, wie eine Kontrolle mit Hilfe von DNA-Fragmentierung, Annexin-V-Markierung und bcl-2-Schutzmaßnahmen zeigte. In weiterem Sinne kann daher geschlussfolgert werden, dass Taxol bei differenzierten SH-SY5Y-Zellen Apoptose einleitet. Es wurde nun gezeigt, dass Enovin dazu befähigt ist, das Ausmaß dieses Zelltods zu verringern, und daher könnte es neuronale Apoptose im Allgemeinen rückgängig machen.
  • Daher könnte die Verbindung bei den folgenden neurodegenerativen Zuständen, bei denen Apoptose beobachtet wurde, hilfreich sein, und zwar Schlaganfall (Hakim, 1998), Parkinson'sche Krankheit (Marsden et al., 1998), Alzheimer (Nagy et al., 1998), Huntington-Krankheit (Wellington et al., 1997), Neurotrauma (Smirnova et al., 1998), periphere Neuropathien (Srinivisan et al., 1998).
  • Als Beispiel für letztere klinische Indikation haben wir gezeigt, dass dieser neurotrophe Faktor differenzierte menschliche SH-SY5Y-Neuroblastomzellen tatsächlich gegen taxolinduzierte Zelltoxizität schützt.
  • Vorgehensweise bei den Messungen der Lebensfähigkeit
  • Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde bestimmt, indem 100 μl einer Lösung von 1 mg/ml an 2,3-bis [2-Methoxy-4-nitro-5-sulphophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilid (XTT, Sigma) in DMEM (37°C), welcher 0,02 mM an Phenazinmethosulfat (PMS, Sigma) zugesetzt worden waren, in jede Kavität gegeben wurden. Die Platten wurden anschließend 2,5 Std. lang bei 37 °C inkubiert. Die optischen Dichtewerte wurden bei 450 nm abgelesen (molekulare Vorrichtungen), wobei 650 nm als Vergleichswert diente. Der XTT-Assay beruht auf der Umwandlung des Tetrazoliumsalzes XTT in ein rotgefärbtes Formazanprodukt. Diese Reaktion erfolgt mittels mitochondrialer Enzyme.
  • Vorgehensweise bei der neuronalen Differenzierung
  • 1. Differenzierung in menschlichen SHSY5Y- Neuroblastomzellen
  • SHSY5Y-Zellen werden 5 Tage lang mit 25 nM Staurosporin differenziert. Die Wirkung von Enovin wird 72 Std. nach Beginn des Versuches gemessen. (Referenz Jalava et al. "Protein Kinase inhibitor staurosporine induces a mature neuronal phenotype in SH-SY5Y human neuroblastoma cells through an a,b,z PKC independent pathway" Journ cell Physiol 155, 301–312 (1993)).
  • 2. Messung der Längenzunahme der Neuriten.
  • Die morphologischen Veränderungen der Neuronen wurden wie folgt automatisch quantifiziert. Zusammenfassend gesagt, wurde zu geeigneten Zeitpunkten Glutaraldehyd direkt in das Medium gegeben, woraufhin dieses bei Raumtemperatur 30 Minuten lang ruhen gelassen wurde. Dadurch wurde gewährleistet, dass die Morphologie der Zellen zu dem jeweiligen Zeitpunkt die tatsächliche Situation widerspiegelte. Die Zellen wurden durch ein Axiovert Mikroskop (Zeiss Oberkochen, Deutschland) beobachtet, welches im Modus des durchgelassenen Lichtes betrieben wurde und mit einem Scantisch versehen war, der über eine Indy Workstation (Silicon Graphics, Mountain View, USA) gesteuert wurde. Die Bildaufnahmen wurden mit einer MX5 Videokamera (HCS) gemacht. Es wurden ungefähr 3000 Zellen in 64 aufeinander ausgerichteten Bildern, die eine quadratische 8×8 Bildmatrix bildeten, ausgewertet. Durch das exakte Ausrichten der Bilder wurde sichergestellt, dass Neuriten auch von einem Bild bis ins nächsten verfolgt werden konnten. Die automatische Detektion der Längenzunahme der Neuriten, die mit dem polyklonalen tau-Antikörper markiert waren, wurde unter Verwendung eines nicht verzerrenden Detektors für kurvilineare Strukturen (Steger 1998) durchgeführt. Die Analysensoftware berechnete automatisch die Gesamtfläche der Zellkörper sowie die Anzahl der Zellkörper und die Gesamtlänge der Neuriten.
  • Um die Wirkung von Enovin auf verschiedene Zellarten zu untersuchen, wurden zwei Assays durchgeführt, ein DNA-Synthese-Assay und ein Chemotaxis-Assay.
  • DNA-Synthese-Assay
  • Zellen einschließlich menschlicher Hautfibroblasten (39SK), menschlicher Venenendothelzellen des Nabels (HWEC), menschlicher glatter Muskelzellen (HSMC), menschlicher Chondrozyten sowie Osteoblasten der Ratte wurden in DMEM, das 10 % FBS enthielt, (39-SK, HSMC, Rattenosteoblasten) beziehungsweise in einem definierten Medium (Chondrozyten and HUVEC) bei 37 °C unter 5 % CO2 und 95 % Luft aufbewahrt. Für den DNA-Synthese-Assay wurden die Zellen in eine Gewebekulturplatte, die 96 Kavitäten aufwies, mit einer Dichte von 5.000 Zellen/Kavität in DMEM, das 10 % FBS enthielt, überimpft und 24 Std. inkubiert. Das Kulturmedium wurde anschließend durch DMEM ersetzt, welches unterschiedliche Konzentrationen an Enovin sowie 0,1 % BSA (für 39-SK, Osteoblasten, HSMC, Chondrozyten) beziehungsweise durch DMEM, welches unterschiedliche Konzentrationen an Enovin sowie 0,5 FBS (für HUVEC), und die Zellen wurden 24 Std. lang inkubiert. Anschließend wurde das Kulturmedium durch 100 μl an DMEM, welches 5 % an FBS und 0, 1 μCi an [3H]-Thymidin enthielt, ersetzt. Nach einer 2stündigen Impulsmarkierung wurden die Zellen mit Methanol/Essigsäure (3:1, vol:vol) 1 Std. lang bei Raumtemperatur fixiert. Die fixierten Zellen wurden zweimal mit 80 %igem Methanol gewaschen. Die Zellen wurden 30 min. lang in 0,05 %igem Trypsin (100 μl/Kavität) und anschließend weitere 30 min. lang in 0,5 %igem SDS (100 μl/Kavität) solubilisiert. Von den Zell-Lysaten wurde Aliquote (180 μl) mit 2 ml Szintillationscocktail kombiniert, und die Radioaktivität der Zell-Lysate wurde unter Verwendung eines Szintillationszählers für Flüssigkeiten (Wallac 1409) gemessen.
  • Chemotaxis-Assay
  • Die Zellen wurden entsprechend der Beschreibung des "DNA-Synthese-Assays" aufbewahrt. Die chemotaktische Aktivität von Enovin wurde unter Verwendung einer modifizierten Boyden-Kammer mit 12 Kavitäten untersucht (McQuillan, D.J., Handley, C.J., Campbell, M.A., Bolis, S., Milway, V.E., Herington, A.C., (1986), "Stimulation of Proteoglycan biosynthesis by serum and insulin-like growth factor-I in cultured bovine articular cartilage", Biochem. J. 240:423–430). Die Zellen wurden mit 0,05 %igem Trypsin und 0,5 mM EDTA trypsiniert und erneut in DMEM in Suspension gebracht. In die unteren Kavitäten einer Boyden-Kammer wurden 150-μl-Aliquote des Mediums, welches unterschiedliche Konzentrationen an Enovin enthielt, gegeben. Auf die unteren Kavitäten wurde eine Polycarbonatmembran (8 μm), die mit 0,1 mg/ml Kollagen des Typs 1 beschichtet war, gelegt, woraufhin die oberen Kavitäten hergerichtet wurden. In die oberen Kavitäten wurden 100-μl-Aliquote an Zellen (70.000 Zellen/ml) gegeben. Nach einer 6stündigen Inkubationszeit wurde das Gerät auseinander genommen. Diejenigen Zellen, die oberhalb der Membran geblieben sind, wurden entfernt. Die Membran wurde mit 10 %igem Formaldehyd 15 min. lang fixiert, woraufhin sie mit konzentriertem Hämotoxylin nach Gill angefärbt wurde. Die Zellen wurden unter dem Mikroskop gezählt (250fache Vergrößerung), und der Durchschnitt der Zählergebnisse aus fünf Bereichen jeder Kavität wurde verwendet. Jeder Versuch wurde mindestens viermal wiederholt. Die Ergebnisse wurden als Mehrfaches des Kontrollansatzes (DMEM mit 0,1 % BSA) ausgedrückt.
  • Wie aus der Darstellung der Ergebnisse in den 8 bis 18 hervorgeht, hat Enovin keinerlei Wirkung auf die Proliferation der verwendeten Zellarten oder auf die Migration der HUVEC-Zellen (14) wie oben beschrieben. Auf SH-SY-5Y-Neuroblastomzellen übt Enovin hingegen eine Wirkung aus. Dies zeigt die selektive Wirkung des Enovins auf Nervenzellen.
  • Es ist gezeigt worden, dass sowohl GDNF als auch NTN Signale über einen Signalleitungskomplex leiten, der aus einer ligandenbindenden Untereinheit, bei der es sich entweder um GFRα-1 oder um GFRα-2 handelt, und aus einer signalleitenden Untereinheit, dem cRET-Protein Tyrosinkinase, bestehen. Von Enovin ist zu erwarten, dass es seine biologische Wirkung über einen ähnlichen Signalleitungskomplex ausübt, welcher aus einem GFRα-artigen Bindungspartner (entweder GFRα-1 oder GFRα-2 oder der jüngst charakterisierte Rezeptor GFRα-3 mit unbekannter Funktion oder andere, noch nicht charakterisierte Mitglieder der GFRα-Familie) in Kombination mit cRET oder einem anderen Signalleitungspartner besteht. In der Tat zeigen die Daten unserer Bindungsuntersuchungen, dass Enovin spezifisch an GFRα-3 binden kann.
  • Beim Menschen können Keimzellmutationen in GDNF oder cRET zu mehreren Krankheitsphänotypen einschließlich multipler endokriner Neoplasie und familiärer Hirschsprung-Krankheit (HSCR) führen (Romeo et al., 1994, Edery et al., 1994, Angrist et al., 1996). Beide Krankheiten gehen mit mangelnder Darmmotilität einher, wobei die Hirschsprung-Krankheit die häufigste Ursuche für angeborenen Darmverschluss bei Kindern ist. Interessanterweise zeigen GDNF- und cRET-Knockoutmäuse auffällig ähnliche Krankheitsbilder mit Nierenagenesie und Darmaganglionose (Sanchez et al., 1996; Moore et al., 1996; Pichel et al., 1996). Enovin könnte bei ähnlichen Störungen der Verdauungsorgane oder der Nieren eine Rolle spielen oder, da es ubiquitär exprimiert wird, es könnte für die Entwicklung anderer peripherer Organe im Körper von Bedeutung sein.
  • Die Wechselwirkung der Liganden mit ihren Rezeptoren wird im Allgemeinen durch die Wechselwirkung spezifischer Bindungen aus besonderen Resten in beiden Proteinen bewirkt. Fragmente eines Proteins können als Agonisten dienen, die den Rezeptor aktivieren, um seine wachstumsfördernden und den Fortbestand sichernden Wirkungen auf Zellen zur Geltung zu bringen. Teile von Enovin oder synthetische Peptide auf Basis der Proteinsequenz des Enovins können daher als Agonisten oder Antagonisten von Nutzen sein, um dessen Rezeptor GFRα3 zu regulieren. Durch Anwendung von Peptidsynthese oder rekombinanten Techniken können Hybrid-Wachstumsfaktoren, die einerseits aus Teilen von GDNF, NTN oder PSP oder beliebigen anderen neurotrophen Faktoren oder Wachstumsfaktoren und andererseits aus Teilen von Enovin bestehen, hergestellt werden, um einen neuartigen synthetischen Wachstumsfaktor mit neuen Eigenschaften zu erhalten.
  • Zwei Pilotversuche wurden durchgeführt, um zu prüfen, ob Enovin bei Ratten nach subplantaren Injektionen taxolinduzierte Mängel in der Sinneswahrnehmung bei Ratten zu ändern vermag. In einem ersten Versuch wurde geprüft, ob eine einzelne Behandlung mit Enovin den taxolinduzierten Mangel in der Sinneswahrnehmung rückgängig machen kann, während in einem zweiten Versuch geprüft wurde, ob Enovin der Entwicklung von taxolinduzierten Mängeln vorbeugen kann.
  • Allmähliche Rückbildung von taxolinduzierter Fehlfunktion in der Sinneswahrnehmung
  • Verfahren
  • Es wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 300 bis 340 Gramm verwendet. Die Tiere wurden einzeln gehalten und erhielten Futter und Wasser in unbegrenzten Mengen. Vor Beginn des Versuches wurden die in Standard-Beobachtungskäfige umgesetzt und nach einer Eingewöhnungszeit von 15 min. wurde der Pin-Prick-Reflex untersucht. Zu diesem Zwecke wurde die plantare Oberfläche der rechten Pfote des Tieres mit einer Nadel stimuliert und die Reaktion auf diesen Nadelstich (pin prick) entweder als vorhanden (Ergebnis = 1) oder als fehlend (Ergebnis = 0) eingestuft. Im Rahmen einer Versuchsrunde wurde dieser Vorgang dreimal wiederholt, wobei zwischen 2 aufeinander folgenden Stimuli ein Zeitintervall von 1 min. lag; somit bestand der Pin-Prick-Test aus 3 Messungen der Reaktivität bezüglich eines Nadelstichs. Es wurden ausschließlich Ratten, die normale Reaktionen auf die 3 Nadelstiche zeigten, für den Versuch verwendet.
  • An drei aufeinander folgenden Tagen erhielten die Tiere am Morgen des Tages eine subplantare Injektion von 50 μl Taxol (3 mg/ml an Paclitaxel, gelöst in Cremophor und in reinem Alkohol plus Wasser) in die rechte hintere Pfote. Im Laufe des nächsten Morgens wurde der Pin-Prick-Reflex erneut überprüfte, und die Tiere, die keine Reaktion auf die 3 Stimuli zeigten, wurden ausgewählt. Diese Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip in Untergruppen (n = 10/Gruppe) eingeteilt, welche in die rechte hintere Pfote eine subplantare Injektion von 75 μl entweder des Vehikels oder der Kochsalzlösung, oder aber von 23 oder 130 μg/ml an Enovin erhielten. Da keine Unterschiede zwischen den Ergebnissen der Tiere, die mit dem Vehikel bzw. mit der Kochsalzlösung behandelt wurden, festgestellt wurden, wurden diese beiden Gruppen zusammengefasst (Kontrollgruppe). An den Tagen 1, 4, 5 und 7 nach der letzten Behandlung wurde der Pin-Prick-Test sowohl am Morgen (zwischen 8 und 9 Uhr) als auch am Abend (zwischen 15:30 und 16:30 Uhr) durchgeführt. Am achten Tag erfolgte ein letzter Pin- Prick-Test am Morgen. Für jedes der Tiere wurde über den Zeitraum hinweg das kumulierte Reaktionsergebnis auf Nadelstiche festgestellt. Da nach der letzten Behandlung mit dem Medikament insgesamt 9 Pin-Prick-Tests durchgeführt wurden (wobei jeder aus 3 Nadelstichstimuli bestand), betrug das höchste Ergebnis, das über die gesamte Versuchsdauer hinweg erzielt werden konnte, 27.
  • Ergebnisse
  • Die wiederholten subplantaren Injektionen von Taxol über 3 aufeinander folgende Tage hinweg führten zu einer akuten Entzündungsreaktion, die bei der Mehrheit der Tiere mit einer mangelnden Reaktion auf den Nadelstichstimulus einherging. Eine subplantare Injektion von Kochsalzlösung oder Vehikel hatte keine Wirkung auf den taxolinduzierten Mangel. Bei der ersten Messung zeigten nur 4 von 20 Kontrolltieren mindestens 1 Reaktion auf die drei Nadelstiche, und der Mittelwert (± SEM) des Pin-Prick-Ergebnisses lag bei der ersten Messung der Kontrolltiere bei 0,25 (± 0,12); Dies ist im Vergleich mit dem Beginn des Versuches zu sehen, wo das mittlere Ergebnis 3,0 (± 0,0) betrug, da sämtliche Tiere auf den Nadelstich reagierten. Sogar nach 8 Messtagen war das Reaktionsvermögen in der Kontrollgruppe noch beeinträchtigt, wobei 11 von 20 Ratten mindestens einmal reagierten und der Mittelwert des Pin-Prick-Ergebnisses bei 0,75 (± 0,18) lag. Innerhalb dieser Kontrollgruppe zeigte keine der Ratten eine normale Reaktion auf alle 3 Stimuli. Das kumulierte Pin-Prick-Ergebnis, das die Kontrolltiere über den Zeitraum hinweg erzielten, ist in 19 dargestellt. Da die Tiere 9mal über einen Zeitraum von 8 Tagen getestet wurden, beträgt das höchstmögliche Ergebnis bei 3 Nadelstichen pro Test 27. Wie die Graphik zeigt, konnte eine subplantare Injektion von Kochsalzlösung oder Vehikel den taxolinduzierten Mangel im Laufe des Testzeitraums nicht rückgängig machen. Das mittlere kumulative Gesamtergebnis der Kontrolltiere betrug am Ende des Versuches 5,10 (± 0,87); es entspricht somit 18,9 % des zu maximal zu erreichenden Ergebnisses.
  • Eine einzige subplantare Injektion von 75 μl an Enovin mit 23 μg/ml führte bei der ersten Messung dazu, dass 4 von 10 Ratten mindestens einmal reagierten, wobei der Mittelwert des Pin-Prick-Ergebnisses bei 0,70 (± 0,33) lag. Am achten Tag reagierten alle 10 Tiere mindestens einmal auf die Nadelstiche und 5 von 10 Ratten zeigten ein normales Reaktionsvermögen. Das durchschnittliche Pin-Prick-Ergebnis dieser Gruppe betrug am achten Tag 2,20 (± 0,29). Verglichen mit den Kontrolltieren war das durchschnittliche kumulative Ergebnis am Ende des 8tägigen Messzeitraums signifikant erhöht (Mann-Whitney U-Test, zweiseitig, p < 0,01), wobei ein Mittelwert des Pin-Prick-Ergebnisses von 14,50 (± 1,96) erreicht wurde (19). Dies entspricht 53,7 % des Maximalergebnisses.
  • Bei subplantarer Injektion von Enovin mit 130 μg/ml wurde des Weiteren eine verbesserte Wirksamkeit im Vergleich mit der Kontrollgruppe festgestellt. Bei der ersten Messung nach 130 μg/ml an Enovin reagierten 6 von 10 Ratten mindestens einmal, wobei der Mittelwert des Pin-Prick-Ergebnisses bei 1,10 (± 0,35) lag. Am achten Tag reagierten alle 10 Tiere auf mindestens einen Nadelstich, wobei der Mittelwert des Ergebnisses bei 2,60 (± 0,22) lag. 8 von 10 Ratten zeigten eine normale Reaktion auf die 3 Nadelstiche. Das durchschnittliche kumulative Pin-Prick-Gesamtergebnis am Ende des Versuches betrug in dieser Gruppe 17,20 (± 1.94). Dies entspricht 63,7 % des möglichen Gesamtergebnisses und ist stellt im Vergleich mit der Kontrollgruppe eine signifikante Verbesserung dar (p < 0,01).
  • Vorbeugung gegen taxolinduzierten Mangel in der Sinneswahrnehmung über einen Zeitraum hinweg
  • Verfahren
  • Es wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 300 bis 340 Gramm verwendet. Die Tiere wurden einzeln gehalten und erhielten Futter und Wasser in unbegrenzten Mengen. Vor Beginn des Versuches wurden die in Standard-Beobachtungskäfige umgesetzt und nach einer Eingewöhnungszeit von 15 min. wurde der Pin-Prick-Reflex untersucht. Zu diesem Zwecke wurde die plantare Oberfläche der rechten Pfote des Tieres mit einer Nadel stimuliert und die Reaktion auf diesen Nadelstich (pin prick) entweder als vorhanden (Ergebnis = 1) oder als fehlend (Ergebnis = 0) eingestuft. Im Rahmen einer Versuchsrunde wurde dieser Vorgang dreimal wiederholt, wobei zwischen 2 aufeinander folgenden Stimuli ein Zeitintervall von 1 min. lag; somit bestand der Pin-Prick-Test aus 3 Messungen der Reaktivität bezüglich eines Nadelstichs. Es wurden ausschließlich Ratten, die normale Reaktionen auf die 3 Nadelstiche zeigten, für den Versuch verwendet (pin prick-Ergebnis 3). Nach dieser Kontrollmessung wurden die Tiere nach dem Zufallsprinzip in Untergruppen (n = 10/Gruppe) eingeteilt, welche in die rechte hintere Pfote eine subplantare Injektion von 75 μl entweder des Vehikels, einer Kochsalzlösung, oder von 23 oder 130 μg/ml an Enovin erhielten. Da keine Unterschiede zwischen den Ergebnissen der Tiere, die mit dem Vehikel bzw. mit der Kochsalzlösung behandelt wurden, festgestellt wurden, wurden diese beiden Gruppen zusammengefasst (Kontrollgruppe). An 3 aufeinander folgenden Tagen erhielten die Tiere am Morgen des Tages eine subplantare Injektion von 50 μl Taxol (3 mg/ml an Paclitaxel, gelöst in Cremophor und in reinem Alkohol plus Wasser) in die rechte hintere Pfote. An den Tagen 1, 4, 5 und 7 nach Taxol wurde der Pin-Prick-Test sowohl am Morgen (zwischen 8 und 9 Uhr) als auch am Abend (zwischen 15:30 und 16:30 Uhr) durchgeführt. Am achten Tag erfolgte ein letzter Pin-Prick-Test am Morgen. Für jedes der Tiere wurde über den Zeitraum hinweg das kumulierte Reaktionsergebnis auf Nadelstiche festgestellt. Da nach der Taxolbehandlung insgesamt 9 Pin-Prick-Tests durchgeführt wurden (wobei jeder aus 3 Nadelstichstimuli bestand), betrug das höchste kumulative Ergebnis, das über die gesamte Versuchsdauer hinweg erzielt werden konnte, 27.
  • Ergebnisse
  • Eine subplantare Injektion von Kochsalzlösung oder Vehikel verhinderte den taxolinduzierten Mangel im Pin-Prick-Test nicht. Beim ersten Testvorgang nach Taxol reagierten 8 von 20 Ratten mindestens einmal, wobei der Mittelwert des Pin-Prick-Ergebnisses bei 0,60 (± 0,18) lag. Am achten Tag war der taxolinduzierte Mangel immer noch vorhanden, wobei nur 8 von 20 Tieren reagierten und der Mittelwert des Ergebnisses bei 0,80 (± 0,25). Bei zwei Tieren hatte sich der Pin-Prick-Reflex normalisiert. Über den Zeitraum hinweg war das kumulative Pin-Prick-Ergebnis ebenfalls vermindert, was zu einem Mittelwert von 6,55 (± 1,08) führte, wobei dies 24,3 % des Maximalergebnisses entsprach (20).
  • Eine Vorbehandlung mit 23 μg/ml an Enovin verringerte die taxolinduzierten Mängel bezüglich des Nadelstichs. Am ersten Tag reagierten 8 von 10 Tieren mindestens einmal, und das durchschnittliche Pin-Prick-Ergebnis betrug 1,70 (± 0,40). Am achten Tag reagierten sämtliche Tiere, wobei der Mittelwert des Ergebnisses bei 2,50 (± 0,27) lag. Hierbei zeigten 7 Tiere eine normale Reaktion bei sämtlichen Nadelstichen, denen sie ausgesetzt wurden. Im Hinblick auf die kumulative Reaktion über den Zeitraum hinweg (20), erfuhr der Mittelwert des Gesamtergebnisses im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikante Verbesserung (p < 0,01) auf 18,40 (± 1,73); dies entspricht 68,1 % des Maximalwertes.
  • Nach einer Vorbehandlung mit 130 μg/ml an Enovin wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt. Hierbei reagierten 6 von 10 Tieren beim ersten Test, wobei der Mittelwert des Pin-Prick-Ergebnisses bei 1,70 (± 0,31) lag. Am achten Tag reagierten alle Tiere mindestens einmal auf die Nadelstichstimulation, wobei der Mittelwert des Ergebnisses bei 2,40 (± 0,22) lag und bei der Hälfte der Tiere alle 3 Reaktionen normal waren. Im Hinblick auf das kumulative Ergebnis betrug der Mittelwert des Ergebnisses am achten Tag 17,70 (± 1,92), was 65,5 des Gesamtergebnisses entspricht.
  • Die vorliegende Versuchsreihe zeigt, dass eine einzige subplantare Injektion von Enovin, gemäß der Bestimmung mittels eines Pin-Prick-Tests, die taxolinduzierten Mängel in der Sinneswahrnehmung zu vermindern vermag. Die Wirksamkeit zeigt sich sowohl wenn das Medikament vor Taxol zur Anwendung kommt als auch bei nachheriger Gabe.
  • Enovin ist ein möglicher Kandidat für Schmerzsyndrome mit einer im Wesentlichen peripheren und zentralen neurogenen Komponente, rheumatische/entzündliche Erkrankungen sowie bei Leitwertstörungen, und es kann bei Vorgängen der Sinneswahrnehmung die Rolle eines Moderators spielen, und zwar nach transdermaler, topischer, lokaler, zentraler (wie etwa epidural, intrathekal oder ähnliches) und systemischer Anwendung. Weiterhin kann Enovin als diagnostisches Werkzeug eingesetzt werden, um nach physiopathologischen Veränderungen in den oben erwähnten Bereichen zu suchen.
  • Vergleich der Expression von Enovin-mRNA in normalen und erkrankten Geweben
  • Die Expression von Enovin-mRNA wurde unter Verwendung des ABI Prism 7700 Systems zur Sequenzerkennung (Taqman; Perkin Elmer) quantitativ untersucht, wobei eine rechtlich geschützte Technologie, die von Pharmagene Laboratories Ltd, Royston, UK entwickelt und durchgeführt wurde, zum Einsatz kam. Das System verwendet eine fluorogene Sonde, um während der PCR sequenzspezifische fluoreszierende Signale zu erzeugen. Bei der Sonde handelt es sich um ein Oligonukleotid, an welches fluoreszierende Reporter und Quencher angefügt wurden, es befindet sich zwischen den Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primern Solange es intakt ist, wird die Fluoreszenzintensität des Reporters von dem Quencher ausgelöscht. Wenn die Sonde jedoch Teil eines Replizierungskomplexes ist, wird der fluoreszierende Reporter durch die inhärente 5' zu 3' Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase vom Quencher abgespalten. Die Intensitätssteigerung des fluoreszierenden Reportersignals im Laufe der Reaktion dient der direkten Messung der Zunahme des PCR-Produktes. Die Anzahl der Startkopien einer mRNA-Zielsequenz (Cn) wird etabliert, indem die Anzahl der fraktionierenden PCR-Zyklen (Ct), bei welcher ein PCR-Produkt das erste Mal detektiert wird, bestimmt wird – der Punkt, an dem das Fluoreszenzsignal die Grundlinie des Schwellenwertes überschreitet. Die quantitative Bestimmung der Menge an Ziel-mRNA in einer bestimmten Probe erfolgt durch Vergleich der experimentellen Ct-Werte mit einer Standardkurve.
  • Präparation der RNA und Qualitätskontrolle
  • Unter Verwendung des Tri-Zol Reagenzes (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) wurde gemäß den Angaben des Herstellers die gesamte RNA aus intaktem und zerteiltem Gewebe isoliert. Die Qualitätskontrollmaßnahmen, denen sämtliche RNA-Proben unterzogen wurden, umfassten die Bewertung der Integrität (intakte ribosomale 185- und 28S-RNA) und die Bestimmung des Vorhandenseins von Transkripten mit hoher Vorkommensdichte (Actin) und geringer Vorkommensdichte (Transferrinrezeptor).
  • Erstellung der Primer/Sonden
  • Es wurde ein Primerpaar sowie eine Taqman-Sonde erstellt, um eine spezifische Sequenz aus Enovin zu vervielfältigen
    Primer 1: 5' ACGGTTCTCCAGGTGCTGT 3'
    Primer 3: 5' TGCTGCCGACCCACG 3'
    Sonde 5: 5' CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG 3'
  • Zusätzlich dazu wurden ein Primerpaar und eine Taqman-Sonde erstellt, die ein Intron umfassen und einen Abschnitt des menschlichen GAPDH-Gens vervielfältigen
    Primer 2:
    5' CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT 3'
    Primer 4:
    5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 3'
    Sonde 6:
    5' TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT 3'
  • Sonde 5 ist mit dem der fluoreszierenden Komponente FAM markiert, während Sonde 6 mit der fluoreszierenden Komponente VIC markiert ist.
  • DNase-Behandlung der Gesamt-RNA
  • Für jedes der untersuchten Gewebe wurden 2,24μg an Gesamt-RNA mit 2 Einheiten an RNase-freier DNase (Gibco BRL) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Volumen von 20 μl 1× Dnasepuffer (Gibco BRL) verdaut. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μl einer 25mM EDTA-Lösung gestoppt. Anschließend wurden die Proben 10 Minuten lang bei 65 °C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren.
  • Synthese des ersten cDNA-Stranges
  • Für jedes der untersuchten Gewebe wurden 100 ng der Gesamt-RNA als Template für die Synthese des ersten cDNA-Stranges verwendet. Die RNA befand sich in einem Volumen von 4 ml und in Gegenwart von 50nM der Primer 1 und 2, 1×PCR-Puffer II (Perkin Elmer) sowie 5mM MgCl2 und 5 Minuten lang auf 72 °C erhitzt und dann langsam auf 55 °C abgekühlt. Nach Zugabe aller weiteren Reagentien wurde von Reaktionsansatz von 6 ml 30 Minuten lang bei 48 °C inkubiert, woraufhin ein 5minütiger Schritt von 90 °C zur Enzyminaktivierung erfolgte. Am Ende waren die Reaktionsbedingungen wie folgt: 1×PCR-Puffer II, 5mM MgCl2, 1mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 12,5 Einheiten an MuLV reverser Transkriptase (Gibco BRL).
  • PCR-Vervielfältigung der cDNA-Produkte des ersten Stranges
  • Die cDNA, die sich von den 100 ng Gesamt-RNA jeder der Proben ableitete, wurde einer PCR-Vervielfältigung in einer einzigen Reaktion unterzogen, um sowohl das Ziel- als auch das GAPDH-Transkript zu identifizieren. Am Ende betrugen die Primer/Sonde-Konzentrationen für das Ziel 300nM Primer 1, 300nM Primer 3 und 200nM Sonde 5, während sie für GADPH und bei 20nM Primer 2, 20nM Primer 4 und 100nM Sonde 6 lagen. Die Endkonzentration der anderen Reagentien im Reaktionsansatz betrugen 4,5% Glycerin, 1 × TagMan Puffer A (Perkin Elmer), 6,25 mM MgCl2, 430 M dATP, dUTP, dGTP, dCTP, 2,5 Einheiten AmpliTaq Gold. Die PCR-Vervielfältigung wurde in einem ABI 7700 System zur Sequenzerkennung durchgeführt, wobei auf einem ersten Enzymaktivierungsschritt von 12 min. bei 94 °C 45 Zyklen von 94°C für 15 s und 60°C für 1 min (geringstmögliche Temperaturgradientenzeit) folgten.
  • Untersuchte Krankheiten und Gewebe
  • Die Expression von Enovin-mRNA in Geweben, die von erkrankten Patienten stammten, und wurde mit derjenigen in Geweben von normalen Kontrollindividuen verglichen (25 und 26). Die untenstehende Tabelle zeigt die Krankheiten und die entsprechenden Gewebe, die untersucht wurden. Für jeden der Zustände wurden drei erkrankte und drei Kontrollproben untersucht.
  • Figure 00660001
  • Statistische Analyse
  • Für jedes Gruppe von 3 Gewebe wurde der Mittelwert und die Standardabweichung der Ct-Werte (die normalverteilt sind) berechnet, woraufhin diese gemäß der Formel Cn = 10((ct-40.007/-3.623) in Cn-Werte umgerechnet wurden. Weiterhin wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) der Ct-Werte durchgeführt, um die Mittelwerte der Expressionsniveaus der Enovin-mRNA in normalen und in erkrankten Geweben zu vergleichen.
  • Die 25 und 26 zeigen den Mittelwert der Anzahl an Kopien der Enovin-mRNA (± SD; n = 3) in den erkrankten Geweben bzw. in den Kontrollgeweben. Die statistische Analyse zeigte eine signifikanten Erhöhung des Expressionsniveaus von Enovin in der periventrikulären weißen Substanz von Patienten mit multipler Sklerose (p = 0,013). Bei der internen GADPH-Kontrolle zeigte sich kein signifikanter Unterschied (p = 0,79). Obgleich das Expressionsniveau in der periventrikulären weißen Substanz aus normalem Gewebe recht niedrig ist (im Durchschnitt 270 Kopien in 100 ng Gesamt-RNA gegenüber 200.000 Kopien von GADPH), ist das Niveau bei Patienten mit multipler Sklerose dreimal höher (825).
  • Nur ein weitere erkranktes Gewebe zeigte einen signifikanten Unterschied gegenüber dem normalen Kontrollgewebe: bei duktalem Brustadenokarzinom ist das Expressionsniveau der Enovin-mRNA 6mal höher (6.000 gegenüber 1.000; p = 0,007), wobei aber auch die GADPH-Kontrolle signifikant erhöht ist (165.000 gegenüber 44.000; p = 0,03), was wahrscheinlich einen allgemeinen Anstieg der mRNA-Niveaus widerspiegelt.
  • Zusammenfassend ist festzustellen, dass wir entdeckt haben, dass das Niveau an mRNA-Enovin in der periventrikulären weißen Substanz von Patienten mit multipler Sklerose durch Regulierung erhöht wird.
  • Verwendung von zellbasiertem ELISA mit phosphospezifischen Antikörpern für das Screening nach Enovin-Mimetika auf dem GFRα3/cRET-Rezeptorkomplex
  • Das Verfahren kann auch zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten anderer Neurotrophinrezeptoren wie etwa GFRα1, GFRα2, GFRα4, TrkA, TrkB und TrkC eingesetzt werden.
  • Assay
  • Mit Hilfe dieses Assays können wir agonistische oder antagonistische Verbindungen für neurotrophe Wachstumsfaktoren identifizieren, und zwar indem die Aktivierung von wichtigen Signalleitungskinasen, die im neurotrophen Leitungsweg aktiviert werden, gemessen wird, oder indem die Aktivierung der cRET-Rezeptorkinase gemessen wird. Die Aktivierung wird gemessen, indem die Menge an phosphorylierter Kinase oder Rezeptorkinase unter Verwendung phosphospezifischer Antikörper bestimmt wird. Wir verwenden dazu NIH 3T3-Zellen, die zeitweise oder ständig TrkA, TrkB, TrkC, GFRα1/cRET, GFRα2/cRET, GFRα3/cRET oder GFRα4/cRET exprimieren.
  • Die Aktivierung von p42/p44 MAP-Kinase, PKB-Kinase, c-Jun, CREB, JNK/SAPK-Kinase und weiteren Kinasen wird unter Verwendung gewerblich erhältlicher phosphospezifischer Antikörper detektiert. Zusätzlich dazu kann die Aktivierung von cRET durch Verwendung phosphospezifischer cRET-Antikörper deletiert werden.
  • Es wurde folgendermaßen vorgegangen:
    • – NIH 3T3-Zellen werden in 10 %igem Kälberserum auf Platten mit 96 Kavitäten aufgebracht, wobei die Zellen vor der Stimulation eine 80 %ige Konfluenz aufweisen müssen.
    • – Am nächsten Tag wird nach Medium durch serumfreies Medium ersetzt und die Zellen 18 bis 24 Std. ohne Nährstoffzufuhr gelassen.
    • – Nach der Periode ohne Nährstoffzufuhr werden die Zellen zur Positivkontrolle mit Verbindungen und neurotrophen Faktoren stimuliert (10 ng/ml für neurotrophe Faktoren)
    • – Die Zellen werden mit 4 %igem Formaldehyd in PBS 20 min. lang fixiert.
    • – Die Zellen werden 3× mit 200 μl PBS/0,1 % Triton 5 min. lang gewaschen.
    • – Die Zellen werden mit 100 μl 0,6 %igem H2O2 in PBS/0,1 % Triton 20 min. lang behandelt.
    • – Die Zellen werden 3× mit 200 μl PBS/0,1 % Triton 5 min. lang gewaschen.
    • – Die Zellen werden mit 100 μl 10 %igem fötalem Kälberserum in PBS/0,1 % Triton 60 min. lang blockiert.
    • – Die Zellen werden mit phosphospezifischem Antikörper in 50 μl 5 %igem BSA//PBS/0,1 % Triton bei 4 °C über Nacht inkubiert Die Verdünnung des Antikörpers sollte experimentell bestimmt werden, ein empfehlenswerter Bereich ist 1:100 bis 1:250.
    • – Die Zellen werden 3× mit 200 μl PBS/0,1 % Triton 5 min. lang gewaschen.
    • – Es wird mit dem sekundären Antikörper, an den HRP gebunden ist und dessen Verdünnung 1:100 in 50 μl 5% BSA/PBS/0,1% Triton beträgt, 1 Std. lang bei Raumtemperatur inkubiert.
    • – Die Zellen werden 3× mit 200 μl PBS/0,1 % Triton 5 min. lang gewaschen.
    • – Es wird eine OPD-Tablette (Sigma) in 25 ml Puffer (3,65 g Zitronensäure-H2O und 5,9 g Na2HPO4-2H2O in 0,5 l H2O, pH 5,6) aufgelöst und 12,5 μl H2O2 zugesetzt. 50 μl werden in jede Kavität gegeben und nach Abdecken mit Alufolie 15 min. lang auf einem Schüttelgerät (200 μ/min) inkubiert.
    • – Die Reaktion wird mit 25 μl H2SO4 gestoppt.
    • – Der OD490-650-Wert wird auf dem ELISA-Lesegerät gemessen.
  • Dopaminerge Nervenzellkultur aus dem Mittelhirn
  • Nervenzellkultur
  • Die Nervenzellkulturen wurden aus dem ventralen Mittelhirn der fötalen Ratte durch enzymatische und mechanische Dispersion angelegt. Das Gewebe wurde entnommen, in eiskaltem phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die frei von Ca2+ und Mg2+ war und 0,6 % Glucose enthielt (PBSG) gewaschen und 30 min. lang mit PBSG, die 0,1 % Trypsin enthielt, bei 37 °C inkubiert. Die Zellsuspension wurde in einer Dichte von 2,5 105 Zellen/cm2 auf NUNC Gewebekulturplatten mit 96 Kavitäten aufgebracht. Zuvor waren die Kulturplatten mit Poly-L-Ornithin und CDM, welches 10 % fötales Kälberserum enthielt, beschichtet worden. Die Kulturen wurden in chemisch definiertem Medium (CDM) gehalten, das aus einer 1:1-Mischung aus modifiziertem Eagles Medium nach Dulbecco und F12 Nährlösung, welcher Glucose (0.6 %), Glutamin (2 mM), Natriumhydrogencarbonat (3 mM), HEPES (5 mM), Insulin (25 μg/ml), menschliches Transferrin (100 μg/ml), Putrescin (60 μg/ml), Natriumselenit (30 nM), Streptomycin (100 μg/ml) und Penicillin (100 IU/ml) zugesetzt waren, bestand.
  • Behandlung mit neurotrophen Faktoren
  • Als Stammlösung wurden die Neurotrophine in 0,5 %igem bovinen Serumalbumin aufgelöst. Die Neurotrophine wurden 3 Std. nach dem Anlegen der Platte sowie nach 5 Tagen in Kultur zugesetzt. Eine gleiche Menge an 0,5 %igem bovinen Serumalbumin wurde in den Kontrollkavitäten gegeben.
  • Dopaminaufnahme mit hoher Affinität
  • Nach 10 Tagen wurde die Dopaminaufnahme gemessen. Für den Aufnahmeversuch wurden die Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS, welcher Glucose (5 mM), Ascorbinsäure (100 mM) and Pargylin (100 mM) zugesetzt worden war, gewaschen und mit der gleichen Lösung 10 min. lang vorinkubiert. Die Vorinkubationslösung wurde durch eine gleichartige Lösung, die 50 nM [3H]DA enthielt, ersetzt und die Inkubation 15 min. lang bei 37 °C fortgesetzt. Die Aufnahme wurde durch 3 schnelle Waschschritte mit eiskaltem PBS gestoppt. Das aufgenommene [3H]Dopamin wurde durch 30minütige Inkubation mit angesäuertem Ethanol bei Raumtemperatur freigesetzt. Nach Zugabe von 4 ml Szintillationsflüssigkeit (Packard ultima gold MV) wurde die Radioaktivität unter Verwendung eines Packard Szintillationszählers bestimmt. Die unspezifische Aufnahme wurde durch Zusatz von 20 μM Kokain bestimmt.
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Die Zellen wurden 10 Tage lang in Gegenwart bzw. in Abwesenheit von Enovin kultiviert. Die unbehandelten Kontrollversuche wurden gleich 100 % gesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse basieren auf 1 bis 5 unabhängigen Versuchen.
  • Literaturverzeichnis
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  • Liste der Abkürzungen
    • BLAST
    basic local alignment search tool (Grundlegendes Werkzeug für die Suche nach lokalen Sequenzübereinstimmungen)
    bp
    base pairs (Basenpaare)
    cDNA
    complementary DNA (komplementäre DNA)
    CNS
    central nervous system (zentrales Nervensystem
    EST
    expressed sequence tag (exprimierter Sequenzmarker)
    EVN
    Enovin
    GDNF
    glial cell-line derived neurotrophic factor (Neurotropher Faktor, der sich aus Gliazell-Linien entwickelt)
    GFRα
    α-Rezeptor aus der GDNF-Familie
    GPI
    Glycosyl-Phosphatidyl-Inosit
    MTC
    multiple tissue cDNA (cDNA aus mehreren Gewebearten)
    NTN
    Neurturin
    PCR
    polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
    PNS
    Peripheres Nervensystem
    PSP
    Persephin
    RT-PCR
    PCR mit umgekehrter Transkriptionsrichtung
    TGF-β
    transforming growth factor β (transformierender β-Wachstumsfaktor)
    FISH
    Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
    MTN
    multiple tissue northern (Northern mit Einsatz mehrerer Gewebearten)
    NGF
    nerve growth factor (Nervenwachstumsfaktor)
    SPR
    surface plasmon resonance (Oberflächenplasmonenresonanz)
  • LISTE DER SEQUENZEN
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Claims (35)

  1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend für einen menschlichen neurotrophischen Wachstumsfaktor mit der Bezeichnung Enovin und mit der in der SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder codierend für eine die in der SEQ ID Nr. 9 bzw. SEQ ID Nr. 10 dargestellten Aminosäuresequenzen umfassende Spleißvariante.
  2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei es sich um ein DNA-Molekül handelt.
  3. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich um ein cDNA-Molekül handelt.
  4. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der Nukleinsäuresequenz von Position 81 bis 419 der in der SEQ ID Nr. 2 dargestellten Sequenz.
  5. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer der Sequenz einer der Spleißvarianten mit der Bezeichnung SEQ ID Nr. 11, 12, 13, 14 bzw. 15 entsprechenden Nukleinsäuresequenz.
  6. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit der in der SEQ ID Nr. 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz.
  7. Isolierter menschlicher neurotrophischer Wachstumsfaktor, codiert von einem Nukleinsäuremolekül mit der in einem der Ansprüche 1 bis 6 angegebenen Bedeutung.
  8. Wachstumsfaktor nach Anspruch 8, umfassend die Aminosäuresequenz von Position 27 bis 139 der in der SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz oder umfassend die in der SEQ ID Nr. 9 bzw. SEQ ID Nr. 10 dargestellten Aminosäuresequenzen.
  9. Wachstumsfaktor nach Anspruch 8 oder 9, umfassend die in der SEQ ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz.
  10. Wachstumsfaktor nach Anspruch 8, bestehend aus den in der SEQ ID Nr. 9 bzw. SEQ ID Nr. 10 dargestellten Aminosäuresequenzen.
  11. Isolierter menschlicher neurotrophischer Wachstumsfaktor, umfassend ein Polypeptid mit den in der SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 9 bzw. SEQ ID Nr. 10 dargestellten Aminosäuresequenzen.
  12. Plasmid EVNmat/pRSETB, hinterlegt unter der LMBP-Zugangsnr. LMBP 3931.
  13. Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 2 bis 6.
  14. Expressionsvektor nach Anspruch 13, umfassend eine weitere, für ein Reportermolekül codierende Nukleinsäuresequenz.
  15. Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 14.
  16. Wirtszelle nach Anspruch 15, bei der es sich um eine eukaryontische Zelle oder eine Bakterienzelle handelt.
  17. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das für eine Sequenz codiert, die eine Aminosäurehomologie von wenigstens 70% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 aufweist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Schmerzsyndromen mit einer weitgehend peripheren oder zentralen neurogenen Komponente, rheumatischen/entzündlichen Erkrankungen ebenso wie Leitwertstörungen.
  18. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Medizin.
  19. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Schmerzsyndromen mit einer weitgehend peripheren oder zentralen neurogenen Komponente, rheumatischen/entzündlichen Erkrankungen ebenso wie Leitwertstörungen.
  20. Verwendung eines neurotrophischen Wachstumsfaktors, der eine Aminosäurehomologie von wenigstens 70% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 aufweist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Schmerzsyndromen mit einer weitgehend peripheren oder zentralen neurogenen Komponente, rheumatischen/entzündlichen Erkrankungen ebenso wie Leitwertstörungen.
  21. Neurotrophischer Wachstumsfaktor nach einem der Ansprüche 8 bis 11 zur Verwendung als Medizin.
  22. Verwendung eines neurotrophischen Wachstumsfaktors nach einem der Ansprüche 8 bis 11 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Schmerzsyndromen mit einer weitgehend peripheren oder zentralen neurogenen Komponente, rheumatischen/entzündlichen Erkrankungen ebenso wie Leitwertstörungen.
  23. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Verdünnungs- oder Hilfsmittel dafür.
  24. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Wachstumsfaktor nach einem der Ansprüche 8 bis 11 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Verdünnungs- oder Hilfsmittel dafür.
  25. Antikörper, der zur Bindung an einen Wachstumsfaktor nach einem der Ansprüche 8 bis 11 oder ein Epitop davon in der Lage ist.
  26. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 25 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Verdünnungs- oder Hilfsmittel dafür.
  27. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Wachstumsfaktors nach einem der Ansprüche 8 bis 11 in einer Probe, wobei man einen Antikörper nach Anspruch 25 mit der Probe reagieren läßt und eine eventuelle Bindung zwischen dem Antikörper und dem Wachstumsfaktor nachweist.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Antikörper an ein Reportermolekül konjugiert ist.
  29. Kit oder Vorrichtung zum Nachweis des Vorhandenseins eines neurotrophischen Wachstumsfaktors nach einem der Ansprüche 8 bis 11 in einer Probe, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 25 sowie Mittel zur Durchführung der Reaktion zwischen dem Antikörper und der Probe.
  30. Verfahren zur Identifizierung eines Agonisten oder Antagonisten eines menschlichen neurotrophischen Wachstumsfaktors nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei man ein einen Rezeptor für den Wachstumsfaktor exprimierendes Zellgewebe oder einen einen solchen Rezeptor exprimierenden nichtmenschlichen Organismus mit einer Kandidatenverbindung in Gegenwart des Wachstumsfaktors in Kontakt bringt und die Niveaus der RET-Aktivierung in der Zelle, dem Gewebe oder dem Organismus mit einer Kontrolle, die nicht mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wurde, vergleicht.
  31. Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten eines neurotrophischen Wachstumsfaktors nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei man ein einen geeigneten Rezeptor für den Wachstumsfaktor und cRET exprimierendes Zellgewebe oder einen einen solchen Rezeptor und cRET exprimierenden nicht-menschlichen Organismus mit einer Kandidatenverbindung in Gegenwart des Wachstumsfaktors in Kontakt bringt, das Niveau der Aktivierung einer Signalisierungskinase in dem Signaltransduktionsweg, an dem der geeignete Rezeptor als Komponente beteiligt ist, im Anschluß an die Zugabe eines für die Signalkinase spezifischen, an ein Reportermolekül konjugierten Antikörpers im Vergleich zu einem Zellgewebe oder Organismus, das bzw. der nicht mit der Verbindung in Kontakt gebracht wurde, mißt.
  32. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, wobei es sich bei dem neurotrophischen Wachstumsfaktor um Enovin mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 3 handelt.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, wobei es sich bei dem Zellgewebe bzw. Organismus um NIH-3T3-Zellen handelt.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33, wobei es sich bei dem Rezeptor um GFRα1, GFRα2, GFRα3 oder GFRα4 handelt.
  35. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wobei der Antikörper für p42/p44, MAP-Kinase, PKB-Kinase, c-jun, CREB oder JNK/SAPIC-Kinase spezifisch ist.
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